脂質(zhì)體是由同心磷脂雙分子層組成的磷脂囊泡，這些雙分子層包圍起來(lái)形成一個(gè)水性空間[1]（圖1所示）。磷脂尾由兩條疏水的長(zhǎng)脂肪酸鏈組成，它們聚集在一起以ZD限度地減少與水分子的相互作用，即疏水作用。脂質(zhì)體在藥物遞送領(lǐng)域具有重要的意義，因?yàn)槠錈o(wú)毒、生物相容性和可生物降解。最重要的是，它們可以通過(guò)將藥物插入雙層的疏水部分或脂質(zhì)體的水性內(nèi)部來(lái)遞送藥物[2]。此外，脂質(zhì)體可以保護(hù)藥物不被酶降解和被腎臟過(guò)濾掉[2]。

圖1 脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)和修飾以將藥物輸送到特定細(xì)胞

為了將脂質(zhì)體輸送到特定類(lèi)型的細(xì)胞，脂質(zhì)體需要用抗體、配體[2]或其他蛋白質(zhì)或肽進(jìn)行修飾，如圖1所示。一旦修飾的脂質(zhì)體被靶細(xì)胞上的特定受體識(shí)別，它們就會(huì)在稱為受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用的過(guò)程中被細(xì)胞吸收（圖2），從而將藥物分子輸送到細(xì)胞質(zhì)中[3, 4]。例如，葉酸（一種配體）及其結(jié)合受體葉酸結(jié)合蛋白（FBP）通常用于研究癌癥研究中的藥物遞送策略，因?yàn)镕BP在多種人類(lèi)癌癥中過(guò)度表達(dá)，例如卵巢癌、腦癌、腎和肺[3, 4]。

圖2 配體修飾脂質(zhì)體的受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用。DY個(gè)脂質(zhì)體被放大以清楚地顯示配體。在典型的細(xì)胞膜上可以看到配體的受體。配體與受體結(jié)合后，細(xì)胞膜在脂質(zhì)體周?chē)]合形成囊泡，將攜帶藥物的脂質(zhì)體捕獲在其中，然后在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)一步加工以將藥物釋放到細(xì)胞質(zhì)中。

聚乙二醇（PEG）是眾所周知的一種物質(zhì)，通常用于防止蛋白質(zhì)的表面吸附[5]。對(duì)于脂質(zhì)體的應(yīng)用，通常添加PEG以延長(zhǎng)脂質(zhì)體在人體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，因?yàn)闆](méi)有它，未修飾的脂質(zhì)體將在幾小時(shí)內(nèi)被參與免疫反應(yīng)的吞噬細(xì)胞清楚[2, 3]。這是因?yàn)镻EG的存在阻止了吞噬細(xì)胞的非特異性吸附，例如[3]。然而，用PEG修飾脂質(zhì)體的缺點(diǎn)是由于空間位阻，它可能會(huì)降低脂質(zhì)體上的配體與其特異性受體結(jié)合的能力。因此，必須在延長(zhǎng)脂質(zhì)體循環(huán)時(shí)間和ZD化脂質(zhì)體向靶細(xì)胞的遞送效率之間進(jìn)行折衷[2]。

脂質(zhì)體已固定在表面等離子共振（SPR）傳感表面上以研究藥物和脂質(zhì)體的相互作用[6]，并作為一種放大策略來(lái)降低干擾素和細(xì)菌毒素的檢測(cè)限，例如[7]。以下實(shí)驗(yàn)的目的是證明向葉酸修飾脂質(zhì)體中添加PEG2000會(huì)導(dǎo)致與固定在Affinite P4SPR的SPR金傳感表面上的FBP的結(jié)合降低（圖3）。SPR是一種強(qiáng)大的工具，可以實(shí)時(shí)、無(wú)標(biāo)記地表征修飾的脂質(zhì)體。此外，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)使用P4SPR儀器可以讓研究人員即時(shí)執(zhí)行實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，而不是多次使用公共測(cè)試ZX的設(shè)備進(jìn)行反復(fù)測(cè)量，這節(jié)省了大量的寶貴時(shí)間。

圖3 使用Affinite的P4SPR檢測(cè)聚乙二醇化和非聚乙二醇化葉酸修飾脂質(zhì)體的方案

實(shí)驗(yàn)步驟

使用P4SPR在靜態(tài)條件下測(cè)量SPR。為了固定葉酸受體，通過(guò)在MilliQ水中注射500 μL的EDC:NHS 20:5mM來(lái)激活16-MHA涂層的金棱鏡，并反應(yīng)20分鐘。通過(guò)注入1mL 100mM磷酸鹽緩沖液徹底清洗表面。然后，在由100mM磷酸鹽緩沖液（pH=5）、4mM巰基乙醇和10% v/v 甘油組成的緩沖液中注入300 μL 40nM葉酸結(jié)合蛋白（FBP）并反應(yīng)1小時(shí)。FBP固定后，表面用1mL 100mM磷酸鹽緩沖液沖洗，以評(píng)估生物傳感器表面吸附的FBP。注入1mL 1M乙醇胺并反應(yīng)5min以滅活未反應(yīng)的NHS基團(tuán)。傳感器用1mL 1×PBS（pH=7.4）沖洗，并注入500μL脂質(zhì)體樣品。所有脂質(zhì)體懸浮液的濃度為10μM，并固定10min。注入的樣品列于表1中，區(qū)別僅在于在第二個(gè)樣品中添加了DOPE-PEG 2000-NH2。在脂質(zhì)體固定期間，依次用 1 mL 1 x PBS (pH=7.4) 和 1 mL 10 mM 甘氨酸 (pH=1.5) 沖洗表面 5min，ZH用 1 x PBS (pH=7.4)沖洗。

表1

結(jié)果

圖4顯示了一組初步檢測(cè)結(jié)果，其中顯示了每個(gè)樣品的傳感圖（sensorgrams）。首先，數(shù)據(jù)顯示P4SPR能夠通過(guò)葉酸和FBP結(jié)合親和力檢測(cè)脂質(zhì)體，如從~60s到~750s（綠色）和~60s和~800s（黑色）的兩條關(guān)聯(lián)曲線所示）。此外，可以看到，與未聚乙二醇化的葉酸修飾脂質(zhì)體樣品（~110RU，黑色）相比，聚乙二醇化葉酸修飾的脂質(zhì)體樣品（綠色）的共振單位相對(duì)變化（~40RU）較低。這表明脂質(zhì)體表面PEG的存在因?yàn)榭臻g位阻而YZ了葉酸修飾脂質(zhì)體與FBP修飾傳感器表面的一些結(jié)合，即PEG阻止脂質(zhì)體上的葉酸與固定在傳感器表面上的FBP的結(jié)合。

圖4 顯示了每個(gè)脂質(zhì)體樣品獲得共振單位的部分傳感圖

從傳感器表面的表面活化和葉酸修飾到脂質(zhì)體樣品的ZZ注射，該實(shí)驗(yàn)大約需要3小時(shí)才能完成?？係PR運(yùn)行時(shí)間可能更短，因?yàn)樵诔跏歼M(jìn)樣和ZZ進(jìn)樣之間進(jìn)行了一些樣品濃度優(yōu)化。研究人員可以隨時(shí)更改實(shí)驗(yàn)條件這一事實(shí)是在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)擁有P4SPR儀器的優(yōu)勢(shì)。ZH，即使觀察到注射尖峰并且可以優(yōu)化表面化學(xué)和脂質(zhì)體濃度等其他條件，您可以隨時(shí)在P4SPR上重復(fù)和進(jìn)一步開(kāi)發(fā)實(shí)驗(yàn)。

結(jié)論

Affinite P4SPR能夠檢測(cè)葉酸修飾的脂質(zhì)體，更重要的是，由于PEG引起的空間位阻，可以區(qū)分PEG和未聚乙二醇化的葉酸修飾脂質(zhì)體之間的差異，從而降低葉酸對(duì)FBP的親和力。Affinite P4SPR儀器可用作研究人員的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)平臺(tái)，在進(jìn)行生物測(cè)定或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步測(cè)試之前，以快速簡(jiǎn)單的方式表征脂質(zhì)體以獲得藥代動(dòng)力學(xué)特征[8]，從而避免浪費(fèi)寶貴的研究時(shí)間、資源和動(dòng)物。最重要的是，因?yàn)椴恍枰褂霉矞y(cè)試ZX的SPR儀器，P4SPR儀器觸手可及的加速了脂質(zhì)體的研究開(kāi)發(fā)，

致謝

我們感謝 Félix Lussier 博士提供傳感圖數(shù)據(jù)。 Félix Lussier 博士來(lái)自Max Planck Institute醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞生物物理學(xué)系。

Affinite Instruments P4SPR儀器

Affinité Instruments 的 P4SPR 是一款出色的 SPR 儀器，可以提供高質(zhì)量的實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)以滿足您的研究需求。 與執(zhí)行 ELISA 檢測(cè)相比，它不需要標(biāo)記或二次反應(yīng)，并減少了大量寶貴的研究時(shí)間。 由于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，它還可以以比 ELISA 更高的靈敏度檢測(cè)低親和力相互作用。

參考文獻(xiàn)

[1] Parveen Kumar, Peipei Huo, and Bo Liu, “Formulation Strategies for Folate-Targeted Liposomes and Their Biomedical Applications”, Pharmaceutics, 11, 381 (2019).

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[4] Mary Jo Turk, David J. Waters, Philip S. Low, “Folate-conjugated liposomes preferentially target macrophages associated with ovarian carcinoma”, Cancer Lett., 213, 165-172 (2004).

[5] Roger Michel, Stephanie Pasche, Marcus Textor, and David G. Castner, ”The Influence of PEG Architecture on Protein Adsorption and Conformation”, Langmuir, 21, 12327-12332 (2005).

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下一代創(chuàng)新性儀器：Affinité Instruments便攜多通道表面等離子體共振分析儀P4SPR

便攜式，四通道SPR
憑借緊湊的設(shè)計(jì)，您可以通過(guò)減少樣品制備時(shí)間和在工作臺(tái)或現(xiàn)場(chǎng)使用SPR來(lái)更快地進(jìn)行分析測(cè)試。我們獨(dú)特的技術(shù)不僅可以檢測(cè)和監(jiān)測(cè)生物分子如小肽和大蛋白，還可以檢測(cè)和監(jiān)測(cè)農(nóng)藥、微量藥物、自組裝單層和納米材料。
 

•    4通道微流體

•    2750 nm/RI靈敏度

技術(shù)規(guī)格

• 外形物理尺寸（mm）：175 × 155 × 55

• 重量：＜1.3 kg

• USB供電

• 微流體細(xì)胞Z小體積：150 μL

• 金薄膜SPR的典型靈敏度

• 動(dòng)態(tài)范圍從1.30到1.39折射率單位

• 信號(hào)變化系數(shù)＞0.6%

• 多色光源

• LabVIEW作為控制軟件（開(kāi)源）

• 兼容Ridgeview的TraceDrawer

                              

特點(diǎn)與特色

• 便攜/可用

• 高精確度，高準(zhǔn)確度，一次分析包括三次測(cè)量和一次測(cè)控
  

• 復(fù)雜介質(zhì)中直接檢測(cè)

• 可與其他分析技術(shù)（例如HPLC、MS、Raman、Fluo）整合

• 維護(hù)費(fèi)用低

• 強(qiáng)大

• 低吞吐量

• 使用方便

                             

經(jīng)濟(jì)實(shí)惠
P4SPR顯著降低了與大多數(shù)商業(yè)SPR技術(shù)相關(guān)的成本障礙。以很小的成本獲取基準(zhǔn)SPR技術(shù)，以充分利用SPR的優(yōu)勢(shì)并加速您的發(fā)現(xiàn)。

1年保修
我們對(duì)學(xué)生測(cè)試的P4SPR的穩(wěn)健性充滿信心，這就是為什么我們提供一年保修的原因。

專家支持
我們的團(tuán)隊(duì)由表面等離子體共振、分析化學(xué)和儀器科學(xué)、蛋白質(zhì)科學(xué)和工業(yè)分析過(guò)程開(kāi)發(fā)方面的專家組成。我們隨時(shí)準(zhǔn)備為您提供支持。

適用于分子和化學(xué)測(cè)試的無(wú)標(biāo)記和實(shí)時(shí)SPR傳感技術(shù)
P4SPR的3 Ms：主要特點(diǎn)是釋放研究的全部潛力

 

模塊化
適用于不同的光學(xué)條件、流體要求和其他分析技術(shù)如電化學(xué)、HPLC和MS。

移動(dòng)化
比普通教科書(shū)本更小更輕。USB供電的P4SPR可以在幾分鐘內(nèi)打包或準(zhǔn)備。便于在實(shí)驗(yàn)室和現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試。

多通道
四通道設(shè)計(jì)，提供經(jīng)過(guò)背景校正的三重采樣數(shù)據(jù)，每次都能獲得精確、準(zhǔn)確的結(jié)果。

                            

應(yīng)用

• 對(duì)慢動(dòng)力學(xué)和弱生物分子相互作用具有高靈敏度

• 實(shí)驗(yàn)開(kāi)發(fā)

• 結(jié)合確認(rèn)

• 半定量測(cè)試

• 質(zhì)量控制

• OEM系統(tǒng)集成

                        
 
合作者和客戶
 
 

含能材料如 1,3,5- 三硝基氫- 1,3,5-三嗪（RDX）（圖一）已被廣泛用于制造彈藥， 并占世界各地現(xiàn)役和前軍事設(shè)施的污染很大一部分1。大多數(shù)RDX 不會(huì)在土壤保留，并且只能緩慢生物降解。因此，RDX 可以很容易地滲透到地面，污染周?chē)巳旱娘嬘玫牡叵滤?RDX 不僅被歸類(lèi)為潛在的致癌物質(zhì)，如果吸入或攝入它也會(huì)損害神經(jīng)系統(tǒng)。因此，對(duì)于公共安全來(lái)說(shuō)理想情況下，地下水中的 RDX 水平需要長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)以減少 RDX 暴露于人群并限制其潛在的不利健康影響。

圖一  1,3,5-三硝基氫-1,3,5-三嗪的結(jié)構(gòu)（RDX）

目前專門(mén)用于檢測(cè)環(huán)境樣品中的高能材料的 EPA 8330b 方案是在實(shí)驗(yàn)室中通過(guò)集中式的GX液相色譜(HPLC-UV)。 雖然這種方法很靈敏，但由于需要在測(cè)試前進(jìn)行采樣，運(yùn)輸，儲(chǔ)存和樣品制備而造成這種方法非常耗時(shí)。采樣和測(cè)試之間過(guò)程需要提前至少 24 小時(shí)，幾天或幾周都不罕見(jiàn)。使用無(wú)標(biāo)記傳感方法對(duì) RDX 進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試可將采樣時(shí)間從數(shù)天縮短至數(shù)小時(shí)，顯著降低RDX 暴露于關(guān)注區(qū)域人群的風(fēng)險(xiǎn)。

表面等離子體共振(SPR)已經(jīng)被證明在生物傳感中有無(wú)標(biāo)記和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)優(yōu)勢(shì)。開(kāi)發(fā) SRP 的新應(yīng)用中尤其是便攜式應(yīng)用所得益處可擴(kuò)展到對(duì)有害污染物的環(huán)境監(jiān)測(cè)。

在本應(yīng)用筆記中，我們將會(huì)介紹通過(guò)組合創(chuàng)新便攜式SPR 和高度特定 RDX 識(shí)別所進(jìn)行的監(jiān)控井周?chē)叵滤颮DX 的現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)。便攜式 SPR 在不同的分析參數(shù)包括靈敏度，選擇性，檢測(cè)限和溫度的影響證明了潛在適用性， 也相對(duì)比實(shí)驗(yàn)室中集中式的 HPLC-UV 方法達(dá)到更快的測(cè)試。

實(shí)驗(yàn)設(shè)置
P4SPR 設(shè)備設(shè)置

圖二  P4SPR設(shè)置示意圖（上）實(shí)際皮卡車(chē)后部現(xiàn)場(chǎng)設(shè)置（下）

部署 P4SPR 儀器在抽樣現(xiàn)場(chǎng)被選擇在加拿大冬季和夏季(-20?C 至 30?C 的溫差)。為避免雨雪所造成的損害，設(shè)備臨時(shí)被設(shè)置在桌子或墊子上（圖二）。  該設(shè)備由筆記本電腦通過(guò) USB 供電而發(fā)電機(jī)供應(yīng)筆記本的備份電池。蠕動(dòng)泵分兩個(gè)階段來(lái)抽取井水樣品以控制裝置處的流動(dòng)。首先井水樣被泵入大型收集桶中。   然后，收集桶的水再泵入 P4SPR。 在 P4SPR 中，微流體單元的前 3 通道導(dǎo)入水樣到 RDX 選擇性的 SPR 傳感器上。未污染的水樣被導(dǎo)入第四通道中，用于參考信號(hào)來(lái)校正溫度變化（圖  三）。 因此，每個(gè)樣品一式三份進(jìn)行測(cè)量并實(shí)時(shí)校正。

圖三  四通道微流體通道單元和通道示意圖

實(shí)驗(yàn)步驟
傳感器芯片可通過(guò)二苯胺聚合物與 Au 納米顆粒交聯(lián)功能化，具有 RDX 選擇性的分子印跡聚合物(MIP)(圖四)。
SPR 傳感器在實(shí)驗(yàn)室中用 RDX 的水溶液已先前進(jìn)行驗(yàn)證。同時(shí)溫度對(duì) SPR 靈敏度的影響也在實(shí)驗(yàn)室中從 2℃至 36℃ 測(cè)量環(huán)境相關(guān)范圍得到 1nM 至 50nM 的校準(zhǔn)曲線。在現(xiàn)場(chǎng)分析時(shí)，校準(zhǔn)曲線是從上游未污染的水來(lái)制備的。

圖四  在ITO載玻片上沒(méi)有MIP（左）MIP的暗視野圖像，橙色點(diǎn)是金納米粒子（右）2

從井中的收集污染樣品會(huì)根據(jù)凈化水參考信號(hào)分析。此外，每個(gè)傳感器的響應(yīng)都會(huì)經(jīng)過(guò) 10nM RDX 標(biāo)準(zhǔn)響應(yīng)來(lái)歸一化。


結(jié)果和討論
實(shí)驗(yàn)室中的分析驗(yàn)證

在現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試之前，SPR 方法首先在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了驗(yàn)證， 經(jīng)過(guò) 1pM 至 10nM 的 RDX 溶液以 1mL / min 的速度在傳感器上連續(xù)流動(dòng)來(lái)測(cè)量 SPR 傳感器的靈敏度(圖五，上)。

由于實(shí)地考察將面臨極端的季節(jié)寬溫度范圍，實(shí)驗(yàn)室條 件仿真是用來(lái)開(kāi)發(fā)該方法來(lái)考慮和校正溫度對(duì)SPR 響應(yīng)的影響。 從 SPR 傳感器靈敏度可觀察到主要溫度效應(yīng)。但是，對(duì)于，使用 10 nM 的 SPR 信號(hào)對(duì)校準(zhǔn)曲線進(jìn)行每條曲線的歸一化可在相關(guān)溫度范圍內(nèi)為高于 0.1 nM 濃度提供更一致的靈敏度(圖六)。 隨后的現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試中應(yīng)用了該歸一化方法。

圖五  用于RDX檢測(cè)的傳感器校準(zhǔn)的SPR傳感圖（上）SPR響應(yīng)相對(duì)于10nM標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。誤差棒代表三次重復(fù)測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=3）（下）。

圖六  RDX在不同溫度下，歸一化的校準(zhǔn)曲線對(duì)10nM的SPR響應(yīng)

RDX 的現(xiàn)場(chǎng) SPR 測(cè)試
當(dāng)前的SPR 現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試方法幾乎無(wú)任何基礎(chǔ)設(shè)施要求。帳篷，拖車(chē)或 SUV 的后擋板等臨時(shí)避難所已足夠證明在采樣點(diǎn)部署 P4SPR 的可行性(圖 7)。 每個(gè)井口從到達(dá)現(xiàn)場(chǎng)到完成 SPR 分析只需Z多 90 分鐘。 這包括采樣系統(tǒng)和 P4SPR 的設(shè)置，蒸餾水和未污染水的平衡，樣品的測(cè)量以及重新校準(zhǔn)。 與 EPA HPLC-UV 標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試方法相比，SPR 現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試節(jié)省了樣品運(yùn)輸和制備的時(shí)間。 現(xiàn)場(chǎng)SPR 方法明顯更快，特別是在偏遠(yuǎn)地區(qū)更適合頻繁監(jiān)測(cè)環(huán)境樣品。

圖七  部署P4SPR在不同季節(jié)的照片

此外，用現(xiàn)場(chǎng) SPR 方法產(chǎn)生的數(shù)據(jù)顯示出與 HPLC EPA方法 8330b 的良好相關(guān)性。 這證明了現(xiàn)場(chǎng) SPR 方法的巨大潛力不僅可以作為集中測(cè)試的現(xiàn)場(chǎng)篩選工具，甚至可以替代它。

表一 SPR方法和EPA方法8330b的比較報(bào)告，不同的井做現(xiàn)場(chǎng)采樣。報(bào)告的濃度以ppb為單位。2ppb對(duì)應(yīng)于約10nM

P4SPR 優(yōu)勢(shì)
Affinité Instruments 儀器的 P4SPR 重量輕，集成度高， 便于攜帶，適合在各種環(huán)境條件下進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試。 對(duì)現(xiàn)場(chǎng)設(shè)置空間和信號(hào)穩(wěn)定性的Z低要求大大減少了相對(duì)傳統(tǒng)方法(如 HPLC-UV)的采樣時(shí)間。不同的表面化學(xué)物可通過(guò)調(diào)節(jié)SPR 傳感器的選擇性質(zhì)來(lái)取得感興趣的分析物。 此外，SPR 傳感器能夠直接檢測(cè)無(wú)需樣品制備，可稱為一個(gè)通用的傳感器。

結(jié)論

該應(yīng)用報(bào)告證明 P4SPR 為采樣井現(xiàn)場(chǎng)分析 RDX 提供了zhuo越的分析性能。 由于和標(biāo)準(zhǔn) HPLC 方法以及實(shí)驗(yàn)室樣品的 P4SPR 分析具有良好的相關(guān)性，用戶可以放心地將 P4SPR 用于現(xiàn)場(chǎng)快速測(cè)試偏遠(yuǎn)地區(qū)的含能材料。 該儀器的便攜性和堅(jiān)固性已經(jīng)證明它是環(huán)境監(jiān)測(cè)出色的選擇，具有大大擴(kuò)展其他污染物應(yīng)用的潛力。

公司簡(jiǎn)介

Affinité Instruments 成立于 2015 年，是一個(gè)從蒙特利爾大學(xué)衍生的企業(yè)。Affinité Instruments 的創(chuàng)始人在 SPR 領(lǐng)域積累了十多年豐富的研究結(jié)果的知識(shí)，并通過(guò)多元化的商業(yè)，科學(xué)和工程領(lǐng)域經(jīng)驗(yàn)將創(chuàng)新的 SPR 技術(shù)商業(yè)化。

參考文獻(xiàn)

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2 M. Riskin, R. Tel-Vered and I. Willner, Adv. Mater., 2010, 22, 1387–1391.

介紹

免疫分析是一種用于臨床研究、診斷測(cè)試和學(xué)術(shù)研究等領(lǐng)域中生物化學(xué)標(biāo)記物是否存在和含量的檢測(cè)技術(shù)。盡管目前存在幾種免疫分析的測(cè)定方法,但它們都依賴于抗體與其靶蛋白之間的特異性結(jié)合相互作用?？贵w-蛋白質(zhì)結(jié)合動(dòng)力學(xué)和強(qiáng)度攜帶有該系統(tǒng)的獨(dú)特信息。這可以使用 SPR 作為免疫分析形式來(lái)收集這些重要的信息。

盡管 SPR 是一種能夠快速跟蹤蛋白質(zhì)組學(xué)研究和藥物發(fā)現(xiàn)的強(qiáng)大的分析技術(shù)，但其高昂的成本和復(fù)雜性限制了其在學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)中的大量應(yīng)用。

Affinité的P4SPR

Affinité的P4SPR設(shè)備的簡(jiǎn)單、低成本且易于操作等特點(diǎn)降低了SPR應(yīng)用的障礙。

緊湊的P4SPR,其外形尺寸與一個(gè)A4書(shū)本相當(dāng)，可以在實(shí)驗(yàn)室工作臺(tái)上很容易地設(shè)置，并在幾分鐘的培訓(xùn)中由任何人 (從本科生到宇航員,高級(jí)化學(xué)家到周末科學(xué)家)操作。P4SPR 的堅(jiān)固設(shè)計(jì)提供了從幾分鐘到幾個(gè)小時(shí)的獨(dú)特的靈活測(cè)定時(shí)間，以適應(yīng)廣泛的生物分子相互作用動(dòng)力學(xué)。

Affinité的技術(shù)已通過(guò)前列腺癌(PSA / anti-PSA)、酶檢測(cè)(β-乳糖酶)、免疫球蛋白等一系列蛋白質(zhì)-抗體相互作用得到驗(yàn)證。它適用于無(wú)標(biāo)記形式的 ELISA 型分析。我們的防污技術(shù)可在復(fù)雜的生物流體(包括血清和血漿)中提供高信噪比。Affinité將滿足您對(duì)蛋白質(zhì)-抗體相互作用的監(jiān)測(cè)需求。

Cluster of Differentiation 64 / IgG Fab

Fab修飾的 SPR 芯片上 CD64 的滴定曲線

SPR生物分析儀P4SPR簡(jiǎn)要介紹：

便攜4通道表面等離子體共振儀（P4SPR）可以在任何需要的地方提供高質(zhì)量的表面等離子體共振SPR數(shù)據(jù)。其專有的光學(xué)設(shè)計(jì)沒(méi)有移動(dòng)部件，使其更加緊湊和堅(jiān)固。此外，P4SPR建立在Z先進(jìn)設(shè)備中的基準(zhǔn)SPR技術(shù)基礎(chǔ)上：薄金屬膜傳感器。使用USB供電的P4SPR進(jìn)行的每次實(shí)驗(yàn)分析都會(huì)同時(shí)進(jìn)行三次測(cè)量樣品并記錄高精度數(shù)據(jù)的參考信號(hào)。您可以使用TraceDrawer或喜歡的數(shù)據(jù)處理軟件快速處理文本文件中的輸出數(shù)據(jù)，以提取定性和定量信息如濃度、結(jié)合、選擇性、動(dòng)力學(xué)和親和力等。大多數(shù)SPR應(yīng)用目前都是針對(duì)生物分子的相互作用。革新性SPR分析儀P4SPR使SPR解決方案更容易為現(xiàn)有和潛在用戶所用，同時(shí)也正在開(kāi)發(fā)新興應(yīng)用如測(cè)量和監(jiān)測(cè)小分子和納米粒子。

購(gòu)買(mǎi)P4SPR分析儀時(shí)，包含的物品如下：

l  P4SPR儀器（1）

l  USB線纜（1個(gè)USB 2.0 mini-B，1個(gè)USB 2.0 micro-B）

l  P4SPR操作軟件

l  金（Au）芯片（10）

l  PDMS流體通道（3）

l  硬質(zhì)塑料外殼

l  導(dǎo)管和連接器

l  帶有P4SPR控制軟件的USB密鑰

l  TraceDrawer生物分子分析許可證（可選）

技術(shù)規(guī)格

含能材料如 1,3,5- 三硝基氫- 1,3,5-三嗪（RDX）（圖一）已被廣泛用于制造彈藥， 并占世界各地現(xiàn)役和前軍事設(shè)施的污染很大一部分1。大多數(shù)RDX 不會(huì)在土壤保留，并且只能緩慢生物降解。因此，RDX 可以很容易地滲透到地面，污染周?chē)巳旱娘嬘玫牡叵滤?RDX 不僅被歸類(lèi)為潛在的致癌物質(zhì)，如果吸入或攝入它也會(huì)損害神經(jīng)系統(tǒng)。因此，對(duì)于公共安全來(lái)說(shuō)理想情況下，地下水中的 RDX 水平需要長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)以減少 RDX 暴露于人群并限制其潛在的不利健康影響。

圖一  1,3,5-三硝基氫-1,3,5-三嗪的結(jié)構(gòu)（RDX）

目前專門(mén)用于檢測(cè)環(huán)境樣品中的高能材料的 EPA 8330b 方案是在實(shí)驗(yàn)室中通過(guò)集中式的GX液相色譜(HPLC-UV)。 雖然這種方法很靈敏，但由于需要在測(cè)試前進(jìn)行采樣，運(yùn)輸，儲(chǔ)存和樣品制備而造成這種方法非常耗時(shí)。采樣和測(cè)試之間過(guò)程需要提前至少 24 小時(shí)，幾天或幾周都不罕見(jiàn)。使用無(wú)標(biāo)記傳感方法對(duì) RDX 進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試可將采樣時(shí)間從數(shù)天縮短至數(shù)小時(shí)，顯著降低RDX 暴露于關(guān)注區(qū)域人群的風(fēng)險(xiǎn)。

表面等離子體共振(SPR)已經(jīng)被證明在生物傳感中有無(wú)標(biāo)記和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)優(yōu)勢(shì)。開(kāi)發(fā) SRP 的新應(yīng)用尤其是便攜式應(yīng)用所得益處可擴(kuò)展到對(duì)有害污染物的環(huán)境監(jiān)測(cè)。

在本應(yīng)用筆記中，我們將會(huì)介紹通過(guò)組合創(chuàng)新便攜式SPR 和高度特定 RDX 識(shí)別所進(jìn)行的監(jiān)控井周?chē)叵滤颮DX 的現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)。便攜式 SPR 在不同的分析參數(shù)包括靈敏度，選擇性，檢測(cè)限和溫度的影響證明了潛在適用性， 也相對(duì)比實(shí)驗(yàn)室中集中式的 HPLC-UV 方法達(dá)到更快的測(cè)試。

實(shí)驗(yàn)設(shè)置
P4SPR 設(shè)備設(shè)置

圖二  P4SPR設(shè)置示意圖（上）實(shí)際皮卡車(chē)后部現(xiàn)場(chǎng)設(shè)置（下）

部署 P4SPR 儀器在抽樣現(xiàn)場(chǎng)被選擇在加拿大冬季和夏季(-20?C 至 30?C 的溫差)。為避免雨雪所造成的損害，設(shè)備臨時(shí)被設(shè)置在桌子或墊子上（圖二）。  該設(shè)備由筆記本電腦通過(guò) USB 供電而發(fā)電機(jī)供應(yīng)筆記本的備份電池。蠕動(dòng)泵分兩個(gè)階段來(lái)抽取井水樣品以控制裝置處的流動(dòng)。首先井水樣被泵入大型收集桶中。   然后，收集桶的水再泵入 P4SPR。 在 P4SPR 中，微流體單元的前 3 通道導(dǎo)入水樣到 RDX 選擇性的 SPR 傳感器上。未污染的水樣被導(dǎo)入第四通道中，用于參考信號(hào)來(lái)校正溫度變化（圖  三）。 因此，每個(gè)樣品一式三份進(jìn)行測(cè)量并實(shí)時(shí)校正。

圖三  四通道微流體通道單元和通道示意圖

實(shí)驗(yàn)步驟
傳感器芯片可通過(guò)二苯胺聚合物與 Au 納米顆粒交聯(lián)功能化，具有 RDX 選擇性的分子印跡聚合物(MIP)(圖四)。SPR 傳感器在實(shí)驗(yàn)室中用 RDX 的水溶液已先前進(jìn)行驗(yàn)證。同時(shí)溫度對(duì) SPR 靈敏度的影響也在實(shí)驗(yàn)室中從 2℃至 36℃ 測(cè)量環(huán)境相關(guān)范圍得到 1nM 至 50nM 的校準(zhǔn)曲線。在現(xiàn)場(chǎng)分析時(shí)，校準(zhǔn)曲線是從上游未污染的水來(lái)制備的。

圖四  在ITO載玻片上沒(méi)有MIP（左）MIP的暗視野圖像，橙色點(diǎn)是金納米粒子（右）2

從井中的收集污染樣品會(huì)根據(jù)凈化水參考信號(hào)分析。此外，每個(gè)傳感器的響應(yīng)都會(huì)經(jīng)過(guò) 10nM RDX 標(biāo)準(zhǔn)響應(yīng)來(lái)歸一化。

結(jié)果和討論
實(shí)驗(yàn)室中的分析驗(yàn)證

在現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試之前，SPR 方法首先在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了驗(yàn)證， 經(jīng)過(guò) 1pM 至 10nM 的 RDX 溶液以 1mL / min 的速度在傳感器上連續(xù)流動(dòng)來(lái)測(cè)量 SPR 傳感器的靈敏度(圖五，上)。

由于實(shí)地考察將面臨極端的季節(jié)寬溫度范圍，實(shí)驗(yàn)室條件仿真是用來(lái)開(kāi)發(fā)該方法來(lái)考慮和校正溫度對(duì)SPR 響應(yīng)的影響。 從 SPR 傳感器靈敏度可觀察到主要溫度效應(yīng)。但是，對(duì)于，使用 10 nM 的 SPR 信號(hào)對(duì)校準(zhǔn)曲線進(jìn)行每條曲線的歸一化可在相關(guān)溫度范圍內(nèi)為高于 0.1 nM 濃度提供更一致的靈敏度(圖六)。 隨后的現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試中應(yīng)用了該歸一化方法。

圖五  用于RDX檢測(cè)的傳感器校準(zhǔn)的SPR傳感圖（上）SPR響應(yīng)相對(duì)于10nM標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。誤差棒代表三次重復(fù)測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=3）（下）。

圖六  RDX在不同溫度下，歸一化的校準(zhǔn)曲線對(duì)10nM的SPR響應(yīng)

RDX 的現(xiàn)場(chǎng) SPR 測(cè)試
當(dāng)前的SPR 現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試方法幾乎無(wú)任何基礎(chǔ)設(shè)施要求。帳篷，拖車(chē)或 SUV 的后擋板等臨時(shí)避難所已足夠證明在采樣點(diǎn)部署 P4SPR 的可行性(圖 7)。 每個(gè)井口從到達(dá)現(xiàn)場(chǎng)到完成 SPR 分析低于 90 分鐘。 這包括采樣系統(tǒng)和 P4SPR 的設(shè)置，蒸餾水和未污染水的平衡，樣品的測(cè)量以及重新校準(zhǔn)。 與 EPA HPLC-UV 標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試方法相比，SPR 現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試節(jié)省了樣品運(yùn)輸和制備的時(shí)間。 現(xiàn)場(chǎng)SPR 方法明顯更快，特別是在偏遠(yuǎn)地區(qū)更適合頻繁監(jiān)測(cè)環(huán)境樣品。

圖七  部署P4SPR在不同季節(jié)的照片

此外，用現(xiàn)場(chǎng) SPR 方法產(chǎn)生的數(shù)據(jù)顯示出與 HPLC EPA方法 8330b 的良好相關(guān)性。 這證明了現(xiàn)場(chǎng) SPR 方法的巨大潛力不僅可以作為集中測(cè)試的現(xiàn)場(chǎng)篩選工具，甚至可以替代它。

表一 SPR方法和EPA方法8330b的比較報(bào)告，不同的井做現(xiàn)場(chǎng)采樣。報(bào)告的濃度以ppb為單位。2ppb對(duì)應(yīng)于約10nM

P4SPR 優(yōu)勢(shì)
Affinité Instruments 儀器的 P4SPR 重量輕，集成度高， 便于攜帶，適合在各種環(huán)境條件下進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試。 對(duì)現(xiàn)場(chǎng)設(shè)置空間和信號(hào)穩(wěn)定性的要求大大減少了相對(duì)傳統(tǒng)方法(如 HPLC-UV)的采樣時(shí)間。不同的表面化學(xué)物可通過(guò)調(diào)節(jié)SPR 傳感器的選擇性質(zhì)來(lái)取得感興趣的分析物。 此外，SPR 傳感器能夠直接檢測(cè)無(wú)需樣品制備，可稱為一個(gè)通用的傳感器。

結(jié)論

該應(yīng)用報(bào)告證明 P4SPR 為采樣井現(xiàn)場(chǎng)分析 RDX 提供了優(yōu)異的分析性能。 由于和標(biāo)準(zhǔn) HPLC 方法以及實(shí)驗(yàn)室樣品的 P4SPR 分析具有良好的相關(guān)性，用戶可以放心地將 P4SPR 用于現(xiàn)場(chǎng)快速測(cè)試偏遠(yuǎn)地區(qū)的含能材料。 該儀器的便攜性和堅(jiān)固性已經(jīng)證明它是環(huán)境監(jiān)測(cè)出色的選擇，具有大大擴(kuò)展其他污染物應(yīng)用的潛力。

參考文獻(xiàn)

1 M. Mailloux, R. Martel, U. Gabriel, R. Lefebvre, S. Thiboutot and G. Ampleman, J. Environ. Qual., 2008, 37, 1468.

2 M. Riskin, R. Tel-Vered and I. Willner, Adv. Mater., 2010, 22, 1387–1391.

什么是等離子體表面活化？

等離子體表面活化是表面聚合物被等離子體中不同離子的原子取代以增加表面能的過(guò)程。等離子體活化通常用于制備用于接合或印刷的表面。

等離子體活化可以有效進(jìn)行表面活化和改性

如果表面必須被上漆、印刷或膠粘，它們需要表面良好的潤(rùn)濕性以獲得良好的粘合。許多表面甚至在清潔的狀態(tài)中顯示被雜質(zhì)加劇不足的潤(rùn)濕性。結(jié)果，諸如膠粘劑和油墨的液體脫落。

這是因?yàn)楸砻鎻埩Ψ浅５筒⑶也蛔阋赃M(jìn)行進(jìn)一步的處理。 如果未處理的材料被處理，結(jié)果通常會(huì)油漆和清漆無(wú)法完全地粘附并很快又會(huì)松散，或者膠接的零件脫落解體。

這可以通過(guò)等離子體活化來(lái)防止。

表面的等離子體活化增加它的表面能，并產(chǎn)生與液體相關(guān)聯(lián)的分子基團(tuán)。這通過(guò)改善的潤(rùn)濕性顯現(xiàn)，并導(dǎo)致合適液體的最佳粘合。 

導(dǎo)論
乳糖操縱子（lacO）是一組埃希氏菌屬大腸桿菌基因， 負(fù)責(zé)細(xì)菌中的乳糖代謝。乳糖阻遏物對(duì)它的調(diào)節(jié)是分子生物學(xué)中一個(gè)被充分研究的系統(tǒng)。而乳糖阻遏物這一個(gè)DNA 結(jié)合蛋白（lacI）是控制乳糖操縱子的關(guān)鍵。 該系統(tǒng)的平衡解離常數(shù)（KD）通常估計(jì)在 nM 范圍內(nèi)。 

這種 lacO / lacI 系統(tǒng)通常在本科基因調(diào)控的生物化學(xué)和生物學(xué)課程中引入。更高級(jí)關(guān)于 lacO / lacI 的研究包括成像和染色質(zhì)編輯中的應(yīng)用。 

在更廣泛的領(lǐng)域里，SPR 對(duì)蛋白質(zhì)-DNA 復(fù)合物研究在理解基因表達(dá)調(diào)節(jié)途徑中有相當(dāng)重要的地位。
在這篇應(yīng)用筆記我們將分享蒙特利爾大學(xué)學(xué)術(shù)實(shí)驗(yàn)室如何使用 P4SPR 來(lái)確定 lacO / lacI 系統(tǒng)的結(jié)合強(qiáng)度（親和力，KD）。實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員通過(guò)易用的 P4SPR 和相應(yīng)的用戶界面來(lái)開(kāi)發(fā) SPR 測(cè)定，以便于在本科實(shí)驗(yàn)課程中演示該生物系統(tǒng)。

圖1 乳糖操縱子與乳糖阻遏蛋白組合

實(shí)驗(yàn)裝置

系統(tǒng)設(shè)置

圖2 臺(tái)式P4SPR設(shè)置

USB 供電的 P4SPR 可以連接到筆記本電腦，通過(guò) P4SPR控制軟件啟動(dòng)操作控制和數(shù)據(jù)記錄。易于使用的界面讓用戶可以輕松設(shè)置 P4SPR。 首先，把微流體單元（圖3）蓋在金傳感器芯片上并緊密固定在傳感器芯片腔中。然后在樣品和參比通道中注入溶液以穩(wěn)定基線。 S 形樣品通道具有 3 個(gè)平行的感應(yīng)區(qū)域，其可以提供一式三份的樣品測(cè)量以及與參考通道的一次控制測(cè)量。 通過(guò)透明通道可以在直接觀察在通道中是否有形成的氣 泡，以便立即清除而防止任何信號(hào)丟失。

圖3 P4SPR微流體單元

實(shí)驗(yàn)步驟

在達(dá)到基線穩(wěn)定后，將硫醇化的 LacO DNA 注入樣品通道。 固定化自發(fā)地造成強(qiáng)金-硫鍵形成，直到 SPR 表面飽和后產(chǎn)生平臺(tái)信號(hào)。 然后注射互補(bǔ)的 LacO 寡聚體以允許雜交。在結(jié)合測(cè)定之前徹底洗滌傳感器表面。 通過(guò)先前儲(chǔ)備的液蛋白溶液來(lái)制備 5, 20, 50, 100 和200nM 的溶液。 依次注入每種逐漸增加濃度的溶液， 并用其中的大量洗滌溶液和再生緩沖液孵育 10 分鐘，以從先前溶液中除去剩余的 LacI 蛋白。記錄來(lái)自所有4 個(gè)通道的數(shù)據(jù)，然后導(dǎo)出到 Excel 進(jìn)行進(jìn)一步的數(shù)據(jù)分析。
 
結(jié)果和討論
在該實(shí)驗(yàn)中，從樣品通道得到 3 條平行結(jié)合曲線。 對(duì)該信號(hào)進(jìn)行平均后從參考信道信號(hào)中減去來(lái)取得 SPR 信號(hào)相對(duì)于時(shí)間繪制（圖 5）。使用不同濃度的結(jié)合位移來(lái)建立結(jié)合等溫線，從而確定 KD（圖 6）。
計(jì)算的 KD 為 6.4±1.2nM，符合相關(guān)低濃度基于 LacI 的轉(zhuǎn)錄YZ蛋白的文獻(xiàn)報(bào)道值1。值得注意的是，與已發(fā)表論文中使用的 DNA 結(jié)合分析相比，SPR 分析不需要任何 DNA 放射性標(biāo)記，并且可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)結(jié)合相互作用。

P4SPR 優(yōu)勢(shì)
P4SPR 獨(dú)特的模塊式，便攜和多通道設(shè)計(jì)使其成為用于藥物發(fā)現(xiàn)，生物/傳感和系統(tǒng)集成應(yīng)用的靈活臺(tái)式 SPR 工具。 它幾乎不需要樣品制備，使得系統(tǒng)設(shè)置快速簡(jiǎn)單，同時(shí)節(jié)省了用戶在純化試劑盒和試劑上的成本。此外，P4SPR 利用薄膜 SPR 的高靈敏度和更深的穿透深度來(lái)準(zhǔn)確測(cè)量和結(jié)合的親和力。

總結(jié)
P4SPR 成功地展出乳糖操縱子 DNA 與其阻遏蛋白的結(jié)合相互作用，并且數(shù)據(jù)可從之前發(fā)表的文獻(xiàn)驗(yàn)證。 本科生可從該實(shí)驗(yàn)熟悉該 SPR 技術(shù)及其在監(jiān)測(cè)生物分子相互作用中的應(yīng)用。 此外，P4SPR 系統(tǒng)也可考察其他生物系統(tǒng)，如 DNA-DNA，RNA 以及適體對(duì)，可以幫助科研人員更好地了解結(jié)合并揭示生物通路中的功能。
 
致謝
我們要感謝 Philipe Lampron，Shona Teijeiro 和蒙特利爾生物化學(xué)大學(xué)的 SébastienTruche 開(kāi)發(fā)該化驗(yàn)。
 
關(guān)于 Affinité Instruments
Affinité Instruments 成立于 2015 年，是一個(gè)從蒙特利爾大學(xué)衍生的企業(yè)。Affinité Instruments 的創(chuàng)始人在 SPR 領(lǐng)域積累了十多年豐富的研究結(jié)果的知識(shí)，并通過(guò)多元化的商業(yè)，科學(xué)和工程領(lǐng)域經(jīng)驗(yàn)將創(chuàng)新的 SPR 技術(shù)商業(yè)化。

參考文獻(xiàn)
1 Tungtur et al. Reconciling in vitro and in vivo activities of engineered, LacI3 based repressor proteins:Contributions of DNA looping and 4 operator sequence variation. doi: https://doi.org/10.1101/477893