母乳成分分析儀能檢測(cè)病毒嗎?

脂質(zhì)體是由同心磷脂雙分子層組成的磷脂囊泡，這些雙分子層包圍起來形成一個(gè)水性空間[1]（圖1所示）。磷脂尾由兩條疏水的長(zhǎng)脂肪酸鏈組成，它們聚集在一起以ZD限度地減少與水分子的相互作用，即疏水作用。脂質(zhì)體在藥物遞送領(lǐng)域具有重要的意義，因?yàn)槠錈o毒、生物相容性和可生物降解。最重要的是，它們可以通過將藥物插入雙層的疏水部分或脂質(zhì)體的水性內(nèi)部來遞送藥物[2]。此外，脂質(zhì)體可以保護(hù)藥物不被酶降解和被腎臟過濾掉[2]。

圖1 脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)和修飾以將藥物輸送到特定細(xì)胞

為了將脂質(zhì)體輸送到特定類型的細(xì)胞，脂質(zhì)體需要用抗體、配體[2]或其他蛋白質(zhì)或肽進(jìn)行修飾，如圖1所示。一旦修飾的脂質(zhì)體被靶細(xì)胞上的特定受體識(shí)別，它們就會(huì)在稱為受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用的過程中被細(xì)胞吸收（圖2），從而將藥物分子輸送到細(xì)胞質(zhì)中[3, 4]。例如，葉酸（一種配體）及其結(jié)合受體葉酸結(jié)合蛋白（FBP）通常用于研究癌癥研究中的藥物遞送策略，因?yàn)镕BP在多種人類癌癥中過度表達(dá)，例如卵巢癌、腦癌、腎和肺[3, 4]。

圖2 配體修飾脂質(zhì)體的受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用。DY個(gè)脂質(zhì)體被放大以清楚地顯示配體。在典型的細(xì)胞膜上可以看到配體的受體。配體與受體結(jié)合后，細(xì)胞膜在脂質(zhì)體周圍閉合形成囊泡，將攜帶藥物的脂質(zhì)體捕獲在其中，然后在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)一步加工以將藥物釋放到細(xì)胞質(zhì)中。

聚乙二醇（PEG）是眾所周知的一種物質(zhì)，通常用于防止蛋白質(zhì)的表面吸附[5]。對(duì)于脂質(zhì)體的應(yīng)用，通常添加PEG以延長(zhǎng)脂質(zhì)體在人體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，因?yàn)闆]有它，未修飾的脂質(zhì)體將在幾小時(shí)內(nèi)被參與免疫反應(yīng)的吞噬細(xì)胞清楚[2, 3]。這是因?yàn)镻EG的存在阻止了吞噬細(xì)胞的非特異性吸附，例如[3]。然而，用PEG修飾脂質(zhì)體的缺點(diǎn)是由于空間位阻，它可能會(huì)降低脂質(zhì)體上的配體與其特異性受體結(jié)合的能力。因此，必須在延長(zhǎng)脂質(zhì)體循環(huán)時(shí)間和ZD化脂質(zhì)體向靶細(xì)胞的遞送效率之間進(jìn)行折衷[2]。

脂質(zhì)體已固定在表面等離子共振（SPR）傳感表面上以研究藥物和脂質(zhì)體的相互作用[6]，并作為一種放大策略來降低干擾素和細(xì)菌毒素的檢測(cè)限，例如[7]。以下實(shí)驗(yàn)的目的是證明向葉酸修飾脂質(zhì)體中添加PEG2000會(huì)導(dǎo)致與固定在Affinite P4SPR的SPR金傳感表面上的FBP的結(jié)合降低（圖3）。SPR是一種強(qiáng)大的工具，可以實(shí)時(shí)、無標(biāo)記地表征修飾的脂質(zhì)體。此外，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)使用P4SPR儀器可以讓研究人員即時(shí)執(zhí)行實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，而不是多次使用公共測(cè)試ZX的設(shè)備進(jìn)行反復(fù)測(cè)量，這節(jié)省了大量的寶貴時(shí)間。

圖3 使用Affinite的P4SPR檢測(cè)聚乙二醇化和非聚乙二醇化葉酸修飾脂質(zhì)體的方案

實(shí)驗(yàn)步驟

使用P4SPR在靜態(tài)條件下測(cè)量SPR。為了固定葉酸受體，通過在MilliQ水中注射500 μL的EDC:NHS 20:5mM來激活16-MHA涂層的金棱鏡，并反應(yīng)20分鐘。通過注入1mL 100mM磷酸鹽緩沖液徹底清洗表面。然后，在由100mM磷酸鹽緩沖液（pH=5）、4mM巰基乙醇和10% v/v 甘油組成的緩沖液中注入300 μL 40nM葉酸結(jié)合蛋白（FBP）并反應(yīng)1小時(shí)。FBP固定后，表面用1mL 100mM磷酸鹽緩沖液沖洗，以評(píng)估生物傳感器表面吸附的FBP。注入1mL 1M乙醇胺并反應(yīng)5min以滅活未反應(yīng)的NHS基團(tuán)。傳感器用1mL 1×PBS（pH=7.4）沖洗，并注入500μL脂質(zhì)體樣品。所有脂質(zhì)體懸浮液的濃度為10μM，并固定10min。注入的樣品列于表1中，區(qū)別僅在于在第二個(gè)樣品中添加了DOPE-PEG 2000-NH2。在脂質(zhì)體固定期間，依次用 1 mL 1 x PBS (pH=7.4) 和 1 mL 10 mM 甘氨酸 (pH=1.5) 沖洗表面 5min，ZH用 1 x PBS (pH=7.4)沖洗。

表1

結(jié)果

圖4顯示了一組初步檢測(cè)結(jié)果，其中顯示了每個(gè)樣品的傳感圖（sensorgrams）。首先，數(shù)據(jù)顯示P4SPR能夠通過葉酸和FBP結(jié)合親和力檢測(cè)脂質(zhì)體，如從~60s到~750s（綠色）和~60s和~800s（黑色）的兩條關(guān)聯(lián)曲線所示）。此外，可以看到，與未聚乙二醇化的葉酸修飾脂質(zhì)體樣品（~110RU，黑色）相比，聚乙二醇化葉酸修飾的脂質(zhì)體樣品（綠色）的共振單位相對(duì)變化（~40RU）較低。這表明脂質(zhì)體表面PEG的存在因?yàn)榭臻g位阻而YZ了葉酸修飾脂質(zhì)體與FBP修飾傳感器表面的一些結(jié)合，即PEG阻止脂質(zhì)體上的葉酸與固定在傳感器表面上的FBP的結(jié)合。

圖4 顯示了每個(gè)脂質(zhì)體樣品獲得共振單位的部分傳感圖

從傳感器表面的表面活化和葉酸修飾到脂質(zhì)體樣品的ZZ注射，該實(shí)驗(yàn)大約需要3小時(shí)才能完成。總SPR運(yùn)行時(shí)間可能更短，因?yàn)樵诔跏歼M(jìn)樣和ZZ進(jìn)樣之間進(jìn)行了一些樣品濃度優(yōu)化。研究人員可以隨時(shí)更改實(shí)驗(yàn)條件這一事實(shí)是在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)擁有P4SPR儀器的優(yōu)勢(shì)。ZH，即使觀察到注射尖峰并且可以優(yōu)化表面化學(xué)和脂質(zhì)體濃度等其他條件，您可以隨時(shí)在P4SPR上重復(fù)和進(jìn)一步開發(fā)實(shí)驗(yàn)。

結(jié)論

Affinite P4SPR能夠檢測(cè)葉酸修飾的脂質(zhì)體，更重要的是，由于PEG引起的空間位阻，可以區(qū)分PEG和未聚乙二醇化的葉酸修飾脂質(zhì)體之間的差異，從而降低葉酸對(duì)FBP的親和力。Affinite P4SPR儀器可用作研究人員的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)平臺(tái)，在進(jìn)行生物測(cè)定或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步測(cè)試之前，以快速簡(jiǎn)單的方式表征脂質(zhì)體以獲得藥代動(dòng)力學(xué)特征[8]，從而避免浪費(fèi)寶貴的研究時(shí)間、資源和動(dòng)物。最重要的是，因?yàn)椴恍枰褂霉矞y(cè)試ZX的SPR儀器，P4SPR儀器觸手可及的加速了脂質(zhì)體的研究開發(fā)，

致謝

我們感謝 Félix Lussier 博士提供傳感圖數(shù)據(jù)。 Félix Lussier 博士來自Max Planck Institute醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞生物物理學(xué)系。

Affinite Instruments P4SPR儀器

Affinité Instruments 的 P4SPR 是一款出色的 SPR 儀器，可以提供高質(zhì)量的實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)以滿足您的研究需求。 與執(zhí)行 ELISA 檢測(cè)相比，它不需要標(biāo)記或二次反應(yīng)，并減少了大量寶貴的研究時(shí)間。 由于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，它還可以以比 ELISA 更高的靈敏度檢測(cè)低親和力相互作用。

參考文獻(xiàn)

[1] Parveen Kumar, Peipei Huo, and Bo Liu, “Formulation Strategies for Folate-Targeted Liposomes and Their Biomedical Applications”, Pharmaceutics, 11, 381 (2019).

[2] Robert J. Lee and Philip S. Low, “Delivery of Liposomes into Cultured KB Cells via Folate Receptor-mediated Endocytosis”, J. Biol. Chem., 269, 3198-3204 (1994).

[3] Alberto Gabizon, Aviva T. Horowitz, Dorit Goren, Dina Tzemach, Hilary Shmeeda, and Samuel Zalipsky, “In Vivo Fate of Folate-Targeted Polyethylene-Glycol Liposomes in Tumor-Bearing Mice”, Clin. Cancer Res., 9, 6551–6559 (2003).

[4] Mary Jo Turk, David J. Waters, Philip S. Low, “Folate-conjugated liposomes preferentially target macrophages associated with ovarian carcinoma”, Cancer Lett., 213, 165-172 (2004).

[5] Roger Michel, Stephanie Pasche, Marcus Textor, and David G. Castner, ”The Influence of PEG Architecture on Protein Adsorption and Conformation”, Langmuir, 21, 12327-12332 (2005).

[6] Cheryl L. Baird, Elizabeth S. Courtenay, and David G. Myszka, “Surface plasmon resonance characterization of drug/liposome interactions”, Anal. Biochem., 310, 93-99 (2002).

[7] Agustina Gomez-Hens, Juan Manuel Fernandez-Romero, “The role of liposomes in analytical processes”, Trends Analyt. Chem., 24, 9-19 (2005).

[8] B.J. Crielaard, A. Yousefi, J.P. Schillemans, C. Vermehren, K. Buyens, K. Braeckmans, T. Lammers, G. Storm, “An in vitro assay based on surface plasmon resonance to predict the in vivo circulation kinetics of liposomes”, J. Control. Release, 156, 307-314 (2011).