導(dǎo)論
乳糖操縱子（lacO）是一組埃希氏菌屬大腸桿菌基因， 負(fù)責(zé)細(xì)菌中的乳糖代謝。乳糖阻遏物對(duì)它的調(diào)節(jié)是分子生物學(xué)中一個(gè)被充分研究的系統(tǒng)。而乳糖阻遏物這一個(gè)DNA 結(jié)合蛋白（lacI）是控制乳糖操縱子的關(guān)鍵。 該系統(tǒng)的平衡解離常數(shù)（KD）通常估計(jì)在 nM 范圍內(nèi)。 

這種 lacO / lacI 系統(tǒng)通常在本科基因調(diào)控的生物化學(xué)和生物學(xué)課程中引入。更高級(jí)關(guān)于 lacO / lacI 的研究包括成像和染色質(zhì)編輯中的應(yīng)用。 

在更廣泛的領(lǐng)域里，SPR 對(duì)蛋白質(zhì)-DNA 復(fù)合物研究在理解基因表達(dá)調(diào)節(jié)途徑中有相當(dāng)重要的地位。
在這篇應(yīng)用筆記我們將分享蒙特利爾大學(xué)學(xué)術(shù)實(shí)驗(yàn)室如何使用 P4SPR 來(lái)確定 lacO / lacI 系統(tǒng)的結(jié)合強(qiáng)度（親和力，KD）。實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員通過易用的 P4SPR 和相應(yīng)的用戶界面來(lái)開發(fā) SPR 測(cè)定，以便于在本科實(shí)驗(yàn)課程中演示該生物系統(tǒng)。

圖1 乳糖操縱子與乳糖阻遏蛋白組合

實(shí)驗(yàn)裝置

系統(tǒng)設(shè)置

圖2 臺(tái)式P4SPR設(shè)置

USB 供電的 P4SPR 可以連接到筆記本電腦，通過 P4SPR控制軟件啟動(dòng)操作控制和數(shù)據(jù)記錄。易于使用的界面讓用戶可以輕松設(shè)置 P4SPR。 首先，把微流體單元（圖3）蓋在金傳感器芯片上并緊密固定在傳感器芯片腔中。然后在樣品和參比通道中注入溶液以穩(wěn)定基線。 S 形樣品通道具有 3 個(gè)平行的感應(yīng)區(qū)域，其可以提供一式三份的樣品測(cè)量以及與參考通道的一次控制測(cè)量。 通過透明通道可以在直接觀察在通道中是否有形成的氣 泡，以便立即清除而防止任何信號(hào)丟失。

圖3 P4SPR微流體單元

實(shí)驗(yàn)步驟

在達(dá)到基線穩(wěn)定后，將硫醇化的 LacO DNA 注入樣品通道。 固定化自發(fā)地造成強(qiáng)金-硫鍵形成，直到 SPR 表面飽和后產(chǎn)生平臺(tái)信號(hào)。 然后注射互補(bǔ)的 LacO 寡聚體以允許雜交。在結(jié)合測(cè)定之前徹底洗滌傳感器表面。 通過先前儲(chǔ)備的液蛋白溶液來(lái)制備 5, 20, 50, 100 和200nM 的溶液。 依次注入每種逐漸增加濃度的溶液， 并用其中的大量洗滌溶液和再生緩沖液孵育 10 分鐘，以從先前溶液中除去剩余的 LacI 蛋白。記錄來(lái)自所有4 個(gè)通道的數(shù)據(jù)，然后導(dǎo)出到 Excel 進(jìn)行進(jìn)一步的數(shù)據(jù)分析。
 
結(jié)果和討論
在該實(shí)驗(yàn)中，從樣品通道得到 3 條平行結(jié)合曲線。 對(duì)該信號(hào)進(jìn)行平均后從參考信道信號(hào)中減去來(lái)取得 SPR 信號(hào)相對(duì)于時(shí)間繪制（圖 5）。使用不同濃度的結(jié)合位移來(lái)建立結(jié)合等溫線，從而確定 KD（圖 6）。
計(jì)算的 KD 為 6.4±1.2nM，符合相關(guān)低濃度基于 LacI 的轉(zhuǎn)錄YZ蛋白的文獻(xiàn)報(bào)道值1。值得注意的是，與已發(fā)表論文中使用的 DNA 結(jié)合分析相比，SPR 分析不需要任何 DNA 放射性標(biāo)記，并且可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)結(jié)合相互作用。

P4SPR 優(yōu)勢(shì)
P4SPR 獨(dú)特的模塊式，便攜和多通道設(shè)計(jì)使其成為用于藥物發(fā)現(xiàn)，生物/傳感和系統(tǒng)集成應(yīng)用的靈活臺(tái)式 SPR 工具。 它幾乎不需要樣品制備，使得系統(tǒng)設(shè)置快速簡(jiǎn)單，同時(shí)節(jié)省了用戶在純化試劑盒和試劑上的成本。此外，P4SPR 利用薄膜 SPR 的高靈敏度和更深的穿透深度來(lái)準(zhǔn)確測(cè)量和結(jié)合的親和力。

總結(jié)
P4SPR 成功地展出乳糖操縱子 DNA 與其阻遏蛋白的結(jié)合相互作用，并且數(shù)據(jù)可從之前發(fā)表的文獻(xiàn)驗(yàn)證。 本科生可從該實(shí)驗(yàn)熟悉該 SPR 技術(shù)及其在監(jiān)測(cè)生物分子相互作用中的應(yīng)用。 此外，P4SPR 系統(tǒng)也可考察其他生物系統(tǒng)，如 DNA-DNA，RNA 以及適體對(duì)，可以幫助科研人員更好地了解結(jié)合并揭示生物通路中的功能。
 
致謝
我們要感謝 Philipe Lampron，Shona Teijeiro 和蒙特利爾生物化學(xué)大學(xué)的 SébastienTruche 開發(fā)該化驗(yàn)。
 
關(guān)于 Affinité Instruments
Affinité Instruments 成立于 2015 年，是一個(gè)從蒙特利爾大學(xué)衍生的企業(yè)。Affinité Instruments 的創(chuàng)始人在 SPR 領(lǐng)域積累了十多年豐富的研究結(jié)果的知識(shí)，并通過多元化的商業(yè)，科學(xué)和工程領(lǐng)域經(jīng)驗(yàn)將創(chuàng)新的 SPR 技術(shù)商業(yè)化。

參考文獻(xiàn)
1 Tungtur et al. Reconciling in vitro and in vivo activities of engineered, LacI3 based repressor proteins:Contributions of DNA looping and 4 operator sequence variation. doi: https://doi.org/10.1101/477893

導(dǎo)論
乳糖操縱子（lacO）是一組埃希氏菌屬大腸桿菌基因， 負(fù)責(zé)細(xì)菌中的乳糖代謝。乳糖阻遏物對(duì)它的調(diào)節(jié)是分子生物學(xué)中一個(gè)被充分研究的系統(tǒng)。而乳糖阻遏物這一個(gè)DNA 結(jié)合蛋白（lacI）是控制乳糖操縱子的關(guān)鍵。 該系統(tǒng)的平衡解離常數(shù)（KD）通常估計(jì)在 nM 范圍內(nèi)。這種 lacO / lacI 系統(tǒng)通常在本科基因調(diào)控的生物化學(xué)和生物學(xué)課程中引入。更高級(jí)關(guān)于 lacO / lacI 的研究包括成像和染色質(zhì)編輯中的應(yīng)用。 

在更廣泛的領(lǐng)域里，SPR 對(duì)蛋白質(zhì)-DNA 復(fù)合物研究在理解基因表達(dá)調(diào)節(jié)途徑中有相當(dāng)重要的地位。
在這篇應(yīng)用筆記我們將分享蒙特利爾大學(xué)學(xué)術(shù)實(shí)驗(yàn)室如何使用 P4SPR 來(lái)確定 lacO / lacI 系統(tǒng)的結(jié)合強(qiáng)度（親和力，KD）。實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員通過易用的 P4SPR 和相應(yīng)的用戶界面來(lái)開發(fā) SPR 測(cè)定，以便于在本科實(shí)驗(yàn)課程中演示該生物系統(tǒng)。

圖1 乳糖操縱子與乳糖阻遏蛋白組合

實(shí)驗(yàn)裝置

系統(tǒng)設(shè)置

圖2 臺(tái)式P4SPR設(shè)置

USB 供電的 P4SPR 可以連接到筆記本電腦，通過 P4SPR控制軟件啟動(dòng)操作控制和數(shù)據(jù)記錄。易于使用的界面讓用戶可以輕松設(shè)置 P4SPR。 首先，把微流體單元（圖3）蓋在金傳感器芯片上并緊密固定在傳感器芯片腔中。然后在樣品和參比通道中注入溶液以穩(wěn)定基線。 S 形樣品通道具有 3 個(gè)平行的感應(yīng)區(qū)域，其可以提供一式三份的樣品測(cè)量以及與參考通道的一次控制測(cè)量。 通過透明通道可以在直接觀察在通道中是否有形成的氣 泡，以便立即清除而防止任何信號(hào)丟失。

圖3 P4SPR微流體單元

實(shí)驗(yàn)步驟

在達(dá)到基線穩(wěn)定后，將硫醇化的 LacO DNA 注入樣品通道。 固定化自發(fā)地造成強(qiáng)金-硫鍵形成，直到 SPR 表面飽和后產(chǎn)生平臺(tái)信號(hào)。 然后注射互補(bǔ)的 LacO 寡聚體以允許雜交。在結(jié)合測(cè)定之前徹底洗滌傳感器表面。 通過先前儲(chǔ)備的液蛋白溶液來(lái)制備 5, 20, 50, 100 和200nM 的溶液。 依次注入每種逐漸增加濃度的溶液， 并用其中的大量洗滌溶液和再生緩沖液孵育 10 分鐘，以從先前溶液中除去剩余的 LacI 蛋白。記錄來(lái)自所有4 個(gè)通道的數(shù)據(jù)，然后導(dǎo)出到 Excel 進(jìn)行進(jìn)一步的數(shù)據(jù)分析。
 
結(jié)果和討論
在該實(shí)驗(yàn)中，從樣品通道得到 3 條平行結(jié)合曲線。 對(duì)該信號(hào)進(jìn)行平均后從參考信道信號(hào)中減去來(lái)取得 SPR 信號(hào)相對(duì)于時(shí)間繪制（圖 5）。使用不同濃度的結(jié)合位移來(lái)建立結(jié)合等溫線，從而確定 KD（圖 6）。
計(jì)算的 KD 為 6.4±1.2nM，符合相關(guān)低濃度基于 LacI 的轉(zhuǎn)錄YZ蛋白的文獻(xiàn)報(bào)道值1。值得注意的是，與已發(fā)表論文中使用的 DNA 結(jié)合分析相比，SPR 分析不需要任何 DNA 放射性標(biāo)記，并且可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)結(jié)合相互作用。

P4SPR 優(yōu)勢(shì)
P4SPR 獨(dú)特的模塊式，便攜和多通道設(shè)計(jì)使其成為用于藥物發(fā)現(xiàn)，生物/傳感和系統(tǒng)集成應(yīng)用的靈活臺(tái)式 SPR 工具。 它幾乎不需要樣品制備，使得系統(tǒng)設(shè)置快速簡(jiǎn)單，同時(shí)節(jié)省了用戶在純化試劑盒和試劑上的成本。此外，P4SPR 利用薄膜 SPR 的高靈敏度和更深的穿透深度來(lái)準(zhǔn)確測(cè)量和結(jié)合的親和力。

總結(jié)
P4SPR 成功地展出乳糖操縱子 DNA 與其阻遏蛋白的結(jié)合相互作用，并且數(shù)據(jù)可從之前發(fā)表的文獻(xiàn)驗(yàn)證。 本科生可從該實(shí)驗(yàn)熟悉該 SPR 技術(shù)及其在監(jiān)測(cè)生物分子相互作用中的應(yīng)用。 此外，P4SPR 系統(tǒng)也可考察其他生物系統(tǒng)，如 DNA-DNA，RNA 以及適體對(duì)，可以幫助科研人員更好地了解結(jié)合并揭示生物通路中的功能。
 
致謝
我們要感謝 Philipe Lampron，Shona Teijeiro 和蒙特利爾生物化學(xué)大學(xué)的 SébastienTruche 開發(fā)該化驗(yàn)。
 

參考文獻(xiàn)
1 Tungtur et al. Reconciling in vitro and in vivo activities of engineered, LacI3 based repressor proteins:Contributions of DNA looping and 4 operator sequence variation. doi: https://doi.org/10.1101/477893

含能材料如 1,3,5- 三硝基氫- 1,3,5-三嗪（RDX）（圖一）已被廣泛用于制造彈藥， 并占世界各地現(xiàn)役和前軍事設(shè)施的污染很大一部分1。大多數(shù)RDX 不會(huì)在土壤保留，并且只能緩慢生物降解。因此，RDX 可以很容易地滲透到地面，污染周圍人群的飲用的地下水。 RDX 不僅被歸類為潛在的致癌物質(zhì)，如果吸入或攝入它也會(huì)損害神經(jīng)系統(tǒng)。因此，對(duì)于公共安全來(lái)說(shuō)理想情況下，地下水中的 RDX 水平需要長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)以減少 RDX 暴露于人群并限制其潛在的不利健康影響。

圖一  1,3,5-三硝基氫-1,3,5-三嗪的結(jié)構(gòu)（RDX）

目前專門用于檢測(cè)環(huán)境樣品中的高能材料的 EPA 8330b 方案是在實(shí)驗(yàn)室中通過集中式的GX液相色譜(HPLC-UV)。 雖然這種方法很靈敏，但由于需要在測(cè)試前進(jìn)行采樣，運(yùn)輸，儲(chǔ)存和樣品制備而造成這種方法非常耗時(shí)。采樣和測(cè)試之間過程需要提前至少 24 小時(shí)，幾天或幾周都不罕見。使用無(wú)標(biāo)記傳感方法對(duì) RDX 進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試可將采樣時(shí)間從數(shù)天縮短至數(shù)小時(shí)，顯著降低RDX 暴露于關(guān)注區(qū)域人群的風(fēng)險(xiǎn)。

表面等離子體共振(SPR)已經(jīng)被證明在生物傳感中有無(wú)標(biāo)記和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)優(yōu)勢(shì)。開發(fā) SRP 的新應(yīng)用中尤其是便攜式應(yīng)用所得益處可擴(kuò)展到對(duì)有害污染物的環(huán)境監(jiān)測(cè)。

在本應(yīng)用筆記中，我們將會(huì)介紹通過組合創(chuàng)新便攜式SPR 和高度特定 RDX 識(shí)別所進(jìn)行的監(jiān)控井周圍地下水里RDX 的現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)。便攜式 SPR 在不同的分析參數(shù)包括靈敏度，選擇性，檢測(cè)限和溫度的影響證明了潛在適用性， 也相對(duì)比實(shí)驗(yàn)室中集中式的 HPLC-UV 方法達(dá)到更快的測(cè)試。

實(shí)驗(yàn)設(shè)置
P4SPR 設(shè)備設(shè)置

圖二  P4SPR設(shè)置示意圖（上）實(shí)際皮卡車后部現(xiàn)場(chǎng)設(shè)置（下）

部署 P4SPR 儀器在抽樣現(xiàn)場(chǎng)被選擇在加拿大冬季和夏季(-20?C 至 30?C 的溫差)。為避免雨雪所造成的損害，設(shè)備臨時(shí)被設(shè)置在桌子或墊子上（圖二）。  該設(shè)備由筆記本電腦通過 USB 供電而發(fā)電機(jī)供應(yīng)筆記本的備份電池。蠕動(dòng)泵分兩個(gè)階段來(lái)抽取井水樣品以控制裝置處的流動(dòng)。首先井水樣被泵入大型收集桶中。   然后，收集桶的水再泵入 P4SPR。 在 P4SPR 中，微流體單元的前 3 通道導(dǎo)入水樣到 RDX 選擇性的 SPR 傳感器上。未污染的水樣被導(dǎo)入第四通道中，用于參考信號(hào)來(lái)校正溫度變化（圖  三）。 因此，每個(gè)樣品一式三份進(jìn)行測(cè)量并實(shí)時(shí)校正。

圖三  四通道微流體通道單元和通道示意圖

實(shí)驗(yàn)步驟
傳感器芯片可通過二苯胺聚合物與 Au 納米顆粒交聯(lián)功能化，具有 RDX 選擇性的分子印跡聚合物(MIP)(圖四)。
SPR 傳感器在實(shí)驗(yàn)室中用 RDX 的水溶液已先前進(jìn)行驗(yàn)證。同時(shí)溫度對(duì) SPR 靈敏度的影響也在實(shí)驗(yàn)室中從 2℃至 36℃ 測(cè)量環(huán)境相關(guān)范圍得到 1nM 至 50nM 的校準(zhǔn)曲線。在現(xiàn)場(chǎng)分析時(shí)，校準(zhǔn)曲線是從上游未污染的水來(lái)制備的。

圖四  在ITO載玻片上沒有MIP（左）MIP的暗視野圖像，橙色點(diǎn)是金納米粒子（右）2

從井中的收集污染樣品會(huì)根據(jù)凈化水參考信號(hào)分析。此外，每個(gè)傳感器的響應(yīng)都會(huì)經(jīng)過 10nM RDX 標(biāo)準(zhǔn)響應(yīng)來(lái)歸一化。


結(jié)果和討論
實(shí)驗(yàn)室中的分析驗(yàn)證

在現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試之前，SPR 方法首先在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了驗(yàn)證， 經(jīng)過 1pM 至 10nM 的 RDX 溶液以 1mL / min 的速度在傳感器上連續(xù)流動(dòng)來(lái)測(cè)量 SPR 傳感器的靈敏度(圖五，上)。

由于實(shí)地考察將面臨極端的季節(jié)寬溫度范圍，實(shí)驗(yàn)室條 件仿真是用來(lái)開發(fā)該方法來(lái)考慮和校正溫度對(duì)SPR 響應(yīng)的影響。 從 SPR 傳感器靈敏度可觀察到主要溫度效應(yīng)。但是，對(duì)于，使用 10 nM 的 SPR 信號(hào)對(duì)校準(zhǔn)曲線進(jìn)行每條曲線的歸一化可在相關(guān)溫度范圍內(nèi)為高于 0.1 nM 濃度提供更一致的靈敏度(圖六)。 隨后的現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試中應(yīng)用了該歸一化方法。

圖五  用于RDX檢測(cè)的傳感器校準(zhǔn)的SPR傳感圖（上）SPR響應(yīng)相對(duì)于10nM標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。誤差棒代表三次重復(fù)測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=3）（下）。

圖六  RDX在不同溫度下，歸一化的校準(zhǔn)曲線對(duì)10nM的SPR響應(yīng)

RDX 的現(xiàn)場(chǎng) SPR 測(cè)試
當(dāng)前的SPR 現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試方法幾乎無(wú)任何基礎(chǔ)設(shè)施要求。帳篷，拖車或 SUV 的后擋板等臨時(shí)避難所已足夠證明在采樣點(diǎn)部署 P4SPR 的可行性(圖 7)。 每個(gè)井口從到達(dá)現(xiàn)場(chǎng)到完成 SPR 分析只需Z多 90 分鐘。 這包括采樣系統(tǒng)和 P4SPR 的設(shè)置，蒸餾水和未污染水的平衡，樣品的測(cè)量以及重新校準(zhǔn)。 與 EPA HPLC-UV 標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試方法相比，SPR 現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試節(jié)省了樣品運(yùn)輸和制備的時(shí)間。 現(xiàn)場(chǎng)SPR 方法明顯更快，特別是在偏遠(yuǎn)地區(qū)更適合頻繁監(jiān)測(cè)環(huán)境樣品。

圖七  部署P4SPR在不同季節(jié)的照片

此外，用現(xiàn)場(chǎng) SPR 方法產(chǎn)生的數(shù)據(jù)顯示出與 HPLC EPA方法 8330b 的良好相關(guān)性。 這證明了現(xiàn)場(chǎng) SPR 方法的巨大潛力不僅可以作為集中測(cè)試的現(xiàn)場(chǎng)篩選工具，甚至可以替代它。

表一 SPR方法和EPA方法8330b的比較報(bào)告，不同的井做現(xiàn)場(chǎng)采樣。報(bào)告的濃度以ppb為單位。2ppb對(duì)應(yīng)于約10nM

P4SPR 優(yōu)勢(shì)
Affinité Instruments 儀器的 P4SPR 重量輕，集成度高， 便于攜帶，適合在各種環(huán)境條件下進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試。 對(duì)現(xiàn)場(chǎng)設(shè)置空間和信號(hào)穩(wěn)定性的Z低要求大大減少了相對(duì)傳統(tǒng)方法(如 HPLC-UV)的采樣時(shí)間。不同的表面化學(xué)物可通過調(diào)節(jié)SPR 傳感器的選擇性質(zhì)來(lái)取得感興趣的分析物。 此外，SPR 傳感器能夠直接檢測(cè)無(wú)需樣品制備，可稱為一個(gè)通用的傳感器。

結(jié)論

該應(yīng)用報(bào)告證明 P4SPR 為采樣井現(xiàn)場(chǎng)分析 RDX 提供了zhuo越的分析性能。 由于和標(biāo)準(zhǔn) HPLC 方法以及實(shí)驗(yàn)室樣品的 P4SPR 分析具有良好的相關(guān)性，用戶可以放心地將 P4SPR 用于現(xiàn)場(chǎng)快速測(cè)試偏遠(yuǎn)地區(qū)的含能材料。 該儀器的便攜性和堅(jiān)固性已經(jīng)證明它是環(huán)境監(jiān)測(cè)出色的選擇，具有大大擴(kuò)展其他污染物應(yīng)用的潛力。

公司簡(jiǎn)介

Affinité Instruments 成立于 2015 年，是一個(gè)從蒙特利爾大學(xué)衍生的企業(yè)。Affinité Instruments 的創(chuàng)始人在 SPR 領(lǐng)域積累了十多年豐富的研究結(jié)果的知識(shí)，并通過多元化的商業(yè)，科學(xué)和工程領(lǐng)域經(jīng)驗(yàn)將創(chuàng)新的 SPR 技術(shù)商業(yè)化。

參考文獻(xiàn)

1 M. Mailloux, R. Martel, U. Gabriel, R. Lefebvre, S. Thiboutot and G. Ampleman, J. Environ. Qual., 2008, 37, 1468.

2 M. Riskin, R. Tel-Vered and I. Willner, Adv. Mater., 2010, 22, 1387–1391.

含能材料如 1,3,5- 三硝基氫- 1,3,5-三嗪（RDX）（圖一）已被廣泛用于制造彈藥， 并占世界各地現(xiàn)役和前軍事設(shè)施的污染很大一部分1。大多數(shù)RDX 不會(huì)在土壤保留，并且只能緩慢生物降解。因此，RDX 可以很容易地滲透到地面，污染周圍人群的飲用的地下水。 RDX 不僅被歸類為潛在的致癌物質(zhì)，如果吸入或攝入它也會(huì)損害神經(jīng)系統(tǒng)。因此，對(duì)于公共安全來(lái)說(shuō)理想情況下，地下水中的 RDX 水平需要長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)以減少 RDX 暴露于人群并限制其潛在的不利健康影響。

圖一  1,3,5-三硝基氫-1,3,5-三嗪的結(jié)構(gòu)（RDX）

目前專門用于檢測(cè)環(huán)境樣品中的高能材料的 EPA 8330b 方案是在實(shí)驗(yàn)室中通過集中式的GX液相色譜(HPLC-UV)。 雖然這種方法很靈敏，但由于需要在測(cè)試前進(jìn)行采樣，運(yùn)輸，儲(chǔ)存和樣品制備而造成這種方法非常耗時(shí)。采樣和測(cè)試之間過程需要提前至少 24 小時(shí)，幾天或幾周都不罕見。使用無(wú)標(biāo)記傳感方法對(duì) RDX 進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試可將采樣時(shí)間從數(shù)天縮短至數(shù)小時(shí)，顯著降低RDX 暴露于關(guān)注區(qū)域人群的風(fēng)險(xiǎn)。

表面等離子體共振(SPR)已經(jīng)被證明在生物傳感中有無(wú)標(biāo)記和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)優(yōu)勢(shì)。開發(fā) SRP 的新應(yīng)用尤其是便攜式應(yīng)用所得益處可擴(kuò)展到對(duì)有害污染物的環(huán)境監(jiān)測(cè)。

在本應(yīng)用筆記中，我們將會(huì)介紹通過組合創(chuàng)新便攜式SPR 和高度特定 RDX 識(shí)別所進(jìn)行的監(jiān)控井周圍地下水里RDX 的現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)。便攜式 SPR 在不同的分析參數(shù)包括靈敏度，選擇性，檢測(cè)限和溫度的影響證明了潛在適用性， 也相對(duì)比實(shí)驗(yàn)室中集中式的 HPLC-UV 方法達(dá)到更快的測(cè)試。

實(shí)驗(yàn)設(shè)置
P4SPR 設(shè)備設(shè)置

圖二  P4SPR設(shè)置示意圖（上）實(shí)際皮卡車后部現(xiàn)場(chǎng)設(shè)置（下）

部署 P4SPR 儀器在抽樣現(xiàn)場(chǎng)被選擇在加拿大冬季和夏季(-20?C 至 30?C 的溫差)。為避免雨雪所造成的損害，設(shè)備臨時(shí)被設(shè)置在桌子或墊子上（圖二）。  該設(shè)備由筆記本電腦通過 USB 供電而發(fā)電機(jī)供應(yīng)筆記本的備份電池。蠕動(dòng)泵分兩個(gè)階段來(lái)抽取井水樣品以控制裝置處的流動(dòng)。首先井水樣被泵入大型收集桶中。   然后，收集桶的水再泵入 P4SPR。 在 P4SPR 中，微流體單元的前 3 通道導(dǎo)入水樣到 RDX 選擇性的 SPR 傳感器上。未污染的水樣被導(dǎo)入第四通道中，用于參考信號(hào)來(lái)校正溫度變化（圖  三）。 因此，每個(gè)樣品一式三份進(jìn)行測(cè)量并實(shí)時(shí)校正。

圖三  四通道微流體通道單元和通道示意圖

實(shí)驗(yàn)步驟
傳感器芯片可通過二苯胺聚合物與 Au 納米顆粒交聯(lián)功能化，具有 RDX 選擇性的分子印跡聚合物(MIP)(圖四)。SPR 傳感器在實(shí)驗(yàn)室中用 RDX 的水溶液已先前進(jìn)行驗(yàn)證。同時(shí)溫度對(duì) SPR 靈敏度的影響也在實(shí)驗(yàn)室中從 2℃至 36℃ 測(cè)量環(huán)境相關(guān)范圍得到 1nM 至 50nM 的校準(zhǔn)曲線。在現(xiàn)場(chǎng)分析時(shí)，校準(zhǔn)曲線是從上游未污染的水來(lái)制備的。

圖四  在ITO載玻片上沒有MIP（左）MIP的暗視野圖像，橙色點(diǎn)是金納米粒子（右）2

從井中的收集污染樣品會(huì)根據(jù)凈化水參考信號(hào)分析。此外，每個(gè)傳感器的響應(yīng)都會(huì)經(jīng)過 10nM RDX 標(biāo)準(zhǔn)響應(yīng)來(lái)歸一化。

結(jié)果和討論
實(shí)驗(yàn)室中的分析驗(yàn)證

在現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試之前，SPR 方法首先在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了驗(yàn)證， 經(jīng)過 1pM 至 10nM 的 RDX 溶液以 1mL / min 的速度在傳感器上連續(xù)流動(dòng)來(lái)測(cè)量 SPR 傳感器的靈敏度(圖五，上)。

由于實(shí)地考察將面臨極端的季節(jié)寬溫度范圍，實(shí)驗(yàn)室條件仿真是用來(lái)開發(fā)該方法來(lái)考慮和校正溫度對(duì)SPR 響應(yīng)的影響。 從 SPR 傳感器靈敏度可觀察到主要溫度效應(yīng)。但是，對(duì)于，使用 10 nM 的 SPR 信號(hào)對(duì)校準(zhǔn)曲線進(jìn)行每條曲線的歸一化可在相關(guān)溫度范圍內(nèi)為高于 0.1 nM 濃度提供更一致的靈敏度(圖六)。 隨后的現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試中應(yīng)用了該歸一化方法。

圖五  用于RDX檢測(cè)的傳感器校準(zhǔn)的SPR傳感圖（上）SPR響應(yīng)相對(duì)于10nM標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。誤差棒代表三次重復(fù)測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=3）（下）。

圖六  RDX在不同溫度下，歸一化的校準(zhǔn)曲線對(duì)10nM的SPR響應(yīng)

RDX 的現(xiàn)場(chǎng) SPR 測(cè)試
當(dāng)前的SPR 現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試方法幾乎無(wú)任何基礎(chǔ)設(shè)施要求。帳篷，拖車或 SUV 的后擋板等臨時(shí)避難所已足夠證明在采樣點(diǎn)部署 P4SPR 的可行性(圖 7)。 每個(gè)井口從到達(dá)現(xiàn)場(chǎng)到完成 SPR 分析低于 90 分鐘。 這包括采樣系統(tǒng)和 P4SPR 的設(shè)置，蒸餾水和未污染水的平衡，樣品的測(cè)量以及重新校準(zhǔn)。 與 EPA HPLC-UV 標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試方法相比，SPR 現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試節(jié)省了樣品運(yùn)輸和制備的時(shí)間。 現(xiàn)場(chǎng)SPR 方法明顯更快，特別是在偏遠(yuǎn)地區(qū)更適合頻繁監(jiān)測(cè)環(huán)境樣品。

圖七  部署P4SPR在不同季節(jié)的照片

此外，用現(xiàn)場(chǎng) SPR 方法產(chǎn)生的數(shù)據(jù)顯示出與 HPLC EPA方法 8330b 的良好相關(guān)性。 這證明了現(xiàn)場(chǎng) SPR 方法的巨大潛力不僅可以作為集中測(cè)試的現(xiàn)場(chǎng)篩選工具，甚至可以替代它。

表一 SPR方法和EPA方法8330b的比較報(bào)告，不同的井做現(xiàn)場(chǎng)采樣。報(bào)告的濃度以ppb為單位。2ppb對(duì)應(yīng)于約10nM

P4SPR 優(yōu)勢(shì)
Affinité Instruments 儀器的 P4SPR 重量輕，集成度高， 便于攜帶，適合在各種環(huán)境條件下進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試。 對(duì)現(xiàn)場(chǎng)設(shè)置空間和信號(hào)穩(wěn)定性的要求大大減少了相對(duì)傳統(tǒng)方法(如 HPLC-UV)的采樣時(shí)間。不同的表面化學(xué)物可通過調(diào)節(jié)SPR 傳感器的選擇性質(zhì)來(lái)取得感興趣的分析物。 此外，SPR 傳感器能夠直接檢測(cè)無(wú)需樣品制備，可稱為一個(gè)通用的傳感器。

結(jié)論

該應(yīng)用報(bào)告證明 P4SPR 為采樣井現(xiàn)場(chǎng)分析 RDX 提供了優(yōu)異的分析性能。 由于和標(biāo)準(zhǔn) HPLC 方法以及實(shí)驗(yàn)室樣品的 P4SPR 分析具有良好的相關(guān)性，用戶可以放心地將 P4SPR 用于現(xiàn)場(chǎng)快速測(cè)試偏遠(yuǎn)地區(qū)的含能材料。 該儀器的便攜性和堅(jiān)固性已經(jīng)證明它是環(huán)境監(jiān)測(cè)出色的選擇，具有大大擴(kuò)展其他污染物應(yīng)用的潛力。

參考文獻(xiàn)

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2 M. Riskin, R. Tel-Vered and I. Willner, Adv. Mater., 2010, 22, 1387–1391.

       香甜順滑的牛奶是不是人人都愛！額，但有人想說(shuō)愛你不容易！因?yàn)槿樘遣荒褪堋Ｑ芯匡@示全世界范圍內(nèi)亞洲人的乳糖不耐受人群比例Z高，達(dá)到90%以上。每個(gè)人的癥狀表現(xiàn)也不一樣，可能是腹痛，也可能是腹脹、腹瀉等。但是乳制品是人類重要的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，怎樣才能既享用美味的牛奶又減少癥狀發(fā)生呢？食品供應(yīng)商發(fā)明了低乳糖牛奶，這樣大家都可以開森地喝牛奶啦。

       說(shuō)到這里，安東帕旋光儀可以幫助食品供應(yīng)商準(zhǔn)確地檢測(cè)牛奶中的乳糖含量！

檢測(cè)方法

原理

       旋光儀測(cè)定乳糖的含量是基于乳糖的光學(xué)活性。旋光度取決于光程長(zhǎng)l及乳糖的含量：

       剛?cè)芙獾娜樘菚?huì)在α-水合乳糖與β–乳糖間轉(zhuǎn)化，因此測(cè)量前需要等待達(dá)到平衡，可加入幾滴10%的氨水溶液加快轉(zhuǎn)化以達(dá)到平衡，平衡后的比旋度為52.6°，然而無(wú)水α-水合乳糖和β–乳糖的比旋光度為55.4°。

旋光測(cè)定法是一種光學(xué)方法，一束偏振光穿過樣品，故在測(cè)量之前，牛奶中的脂肪及蛋白質(zhì)需要被沉淀析出/ 澄清。

       存在幾種不同的沉淀析出方法，例如，Carrez澄清，醋酸鉛澄清，AOAC參考方法896.01等。

       所有這些方法都基于3個(gè)基本操作：牛奶與試劑混合，澄清，過濾，測(cè)量旋光度，通過旋光度計(jì)算出乳糖含量。

MCP5100/5300/5500 旋光儀帶帕爾貼半導(dǎo)體控溫組件。

某品牌樣品經(jīng)混合、澄清、過濾后測(cè)量結(jié)果（t0為混合時(shí)間，min）：