免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence technique）又稱熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展很早的一種。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項(xiàng)技術(shù)。很早以來就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。

　　細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)（Wound Healing)是一種操作簡單，經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的研究細(xì)胞遷移/腫瘤侵襲的體外試驗(yàn)方法。為了研究細(xì)胞遷移的機(jī)制，科學(xué)家們傳統(tǒng)上轉(zhuǎn)向“劃痕試驗(yàn)”，它利用移液器尖端在多孔板中的單層細(xì)胞上“劃痕”，并觀察間隙所需閉合的時(shí)間（這些有時(shí)也被稱為“傷口閉合”或“傷口愈合”分析）。這種類型的實(shí)驗(yàn)允許分析細(xì)胞遷移，并可以用各種藥物和化學(xué)品來增強(qiáng)，以闡明特定的機(jī)制。

　　在 ibidi 35mm μ-Dish 中培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞，預(yù)置2-Well Culture-Insert。移除插件后，讓細(xì)胞遷移 24 小時(shí)，然后固定在 4% PFA 中，并進(jìn)行透化。VE-鈣粘蛋白（洋紅色）、 F-肌動(dòng)蛋白用鬼筆環(huán)肽（綠色）和細(xì)胞核用DAPI（藍(lán)色）的抗體染色，然后進(jìn)行共聚焦成像。

　　Derek Sung, University of Pennsylvania School of Medicine：

　　我一直都有進(jìn)行劃痕分析。與大多數(shù)體外測定類似，一致性是獲得準(zhǔn)確和可重復(fù)結(jié)果的關(guān)鍵。作為進(jìn)行過無數(shù)次此實(shí)驗(yàn)的人，使用移液器手動(dòng)創(chuàng)建間隙存在一些過去給我?guī)砺闊┑年P(guān)鍵問題。這就是為什么發(fā)現(xiàn) ibidi Culture-Inserts是一種救星。ibidi 細(xì)胞培養(yǎng)插件與傳統(tǒng)的劃痕檢測方法相比具有許多優(yōu)勢：

　　1. 標(biāo)準(zhǔn)的間隙距離

　　傳統(tǒng)劃痕分析和使用移液管手動(dòng)劃痕大挑戰(zhàn)之一是間隙距離不一致。而且，劃痕往往劃不直。因此，起始距離通常會(huì)在幾十到幾百微米之間變化。ibidi 的細(xì)胞培養(yǎng)插件中心會(huì)產(chǎn)生500 μm 無細(xì)胞的人造間隙。這確保了間隙是直的，并且每次的距離都是一致的。

　　2. 干凈的遷移邊緣

　　手動(dòng)劃痕還會(huì)產(chǎn)生未完全去除的自由浮動(dòng)細(xì)胞的問題。這些自由漂浮的細(xì)胞可以通過延遲自由邊緣的遷移、釋放細(xì)胞內(nèi)內(nèi)容物或重新附著來影響遷移率。ibidi 的細(xì)胞培養(yǎng)插件是可移除的，留下干凈筆直的邊緣。

　　3. Z小化細(xì)胞數(shù)

　　傳統(tǒng)的劃痕檢測是在多孔板中完成的，需要一層匯合的細(xì)胞。如果實(shí)驗(yàn)有多種條件（藥物治療或基因操作）并且需要多次重復(fù)，這會(huì)需要增加大量細(xì)胞。對(duì)于珍貴或昂貴的細(xì)胞（例如從難以獲得的組織中分離出的原代細(xì)胞），這些實(shí)驗(yàn)可能變得難以進(jìn)行。ibidi 的細(xì)胞培養(yǎng)插件具有較小的生長面積，可大限度地減少實(shí)驗(yàn)所需的細(xì)胞數(shù)量（準(zhǔn)確地說，每孔0.22 cm 2）。這允許大限度地利用寶貴的細(xì)胞或增加重復(fù)次數(shù)。

　　4. 蓋玻片底皿

　　劃痕分析通常在多孔板中進(jìn)行，底部厚，聚苯乙烯，只允許明場成像和間隙距離的量化。ibidi 的細(xì)胞培養(yǎng)插件具有經(jīng)過組織培養(yǎng)處理和滅菌的蓋玻片底部。這允許進(jìn)行明場和免疫熒光成像。就我個(gè)人而言，我認(rèn)為這是該產(chǎn)品好的方面，讓我們能夠看到如細(xì)胞骨架、細(xì)胞粘附形態(tài)、核形態(tài)等結(jié)構(gòu)。此外，多模態(tài)成像功能大限度地提高了單個(gè)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)量，從而節(jié)省了成本和試劑。

　　5. 單個(gè)實(shí)驗(yàn)的獨(dú)立插件

　　“邊緣效應(yīng)”是指一種細(xì)胞培養(yǎng)現(xiàn)象，其中多孔板外周的孔比內(nèi)孔經(jīng)歷更多的蒸發(fā)，導(dǎo)致不同的條件和潛在的不一致結(jié)果。使用多孔板進(jìn)行劃痕檢測時(shí)可以看到類似的效果，影響結(jié)果的一致性和重現(xiàn)性。ibidi 的細(xì)胞培養(yǎng)插件單獨(dú)包裝，用于單次實(shí)驗(yàn)。這可以防止任何“邊緣效應(yīng)”并確保數(shù)據(jù)一致。另外，培養(yǎng)皿設(shè)計(jì)有蓋子鎖定功能，以確保在處理盤子時(shí)蓋子保持打開狀態(tài)。

　　與槍頭劃痕檢測相比，ibidi 傷口愈合插件可提供更高的重現(xiàn)性

　　由于細(xì)胞遷移開放區(qū)域隨時(shí)間發(fā)生變化。使用 ibidi Culture-Insert 2 孔（左）和用移液器吸頭刮擦產(chǎn)生間隙的對(duì)比。數(shù)據(jù)來源：德國弗萊堡大學(xué)的 M. B?rries。

　　乍一看，槍刮和放置插件的方法似乎是兩種非常相似的創(chuàng)建無細(xì)胞間隙的方法。 然而，仔細(xì)觀察，這兩種方法可能在重要檢測結(jié)果方面的影響有所不同：

倒置熒光顯微鏡下的免疫熒光細(xì)胞：探索微觀世界的奧秘

顯微鏡觀察免疫熒光細(xì)胞是一種重要的實(shí)驗(yàn)方法，用于研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸等成分的表達(dá)、功能和相互作用，目前，免疫熒光顯微鏡已經(jīng)成為生物學(xué)研究中不可或缺的工具之一。

在倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞時(shí)，需要選擇合適的顯微鏡參數(shù)，以確保觀察的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。例如，光源的種類、顯微鏡的分辨率、物鏡放大倍數(shù)和熒光通過率等因素。此外，在進(jìn)行免疫熒光顯微鏡觀察細(xì)胞時(shí)，需要選擇合適的熒光強(qiáng)度和熒光顏色，以避免對(duì)觀察結(jié)果的干擾。

倒置熒光顯微鏡MF52-N采用無限遠(yuǎn)光學(xué)設(shè)計(jì)和數(shù)顯LED熒光模塊，光路經(jīng)過深度優(yōu)化，能提供簡單易用的熒光激發(fā)和高質(zhì)量的相襯、熒光和明場成像，可選雙光路、一體供電、人走燈滅，廣泛用于細(xì)胞培養(yǎng)、生物制藥、醫(yī)療檢測等領(lǐng)域。

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來源：https://www.mshot.com/article/1810.html

　　免疫熒光實(shí)驗(yàn)原理

　　免疫熒光(IF)是使用顯微鏡深入了解細(xì)胞結(jié)構(gòu)和過程的有效方法。此方法可評(píng)估特定蛋白質(zhì)的表達(dá)和位置，使得免疫熒光成為科學(xué)家解決許多細(xì)胞生物學(xué)問題不可或缺的工具。

　　免疫熒光實(shí)驗(yàn)基于以下主要步驟：

　　1.特異性抗體與感興趣的蛋白質(zhì)結(jié)合。

　　2.熒光染料與這些免疫復(fù)合物偶聯(lián)，以便使用顯微鏡觀察感興趣的蛋白質(zhì)。

　　內(nèi)皮細(xì)胞中vWF的免疫熒光染色。肌動(dòng)蛋白用phalloidin染色(綠色)，細(xì)胞核用DAPI染色(藍(lán)色)。

　　區(qū)分直接和間接免疫熒光。在直接免疫熒光中，一抗直接偶聯(lián)到熒光團(tuán)（也稱為熒光色素），便于處理和快速可視化。在間接免疫熒光中，使用特異性結(jié)合一抗的二級(jí)熒光團(tuán)偶聯(lián)抗體來可視化感興趣的結(jié)。

　　盡管di二種方法比直接免疫熒光更耗時(shí)，但它有幾個(gè)顯著的優(yōu)勢，比如它通常更便宜，因?yàn)槎箍梢杂糜诓煌囊豢?。此外，通過結(jié)合多個(gè)一抗和特定的二抗(每個(gè)抗體都用不同的熒光團(tuán)標(biāo)記)，可以在單個(gè)樣品中平行特異地顯示多個(gè)蛋白質(zhì)(多色免疫熒光)。

　　免疫熒光染色:典型的工作流程

　　每個(gè)免疫熒光染色方案由培養(yǎng)、固定、染色、成像四個(gè)主要步驟組成，可細(xì)分如下:

　　免疫熒光染色是一種非常敏感的方法，可能需要排除故障《免疫英冠染色故障排除指南》。方案中的微小變化可能會(huì)導(dǎo)致不同的結(jié)果，而這些結(jié)果不再具有可比性。因此，在您的特定方案中精確地保持完全相同的條件是非常重要的(例如，細(xì)胞密度、抗體稀釋度、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間)。

　　免疫熒光實(shí)驗(yàn)方案對(duì)比

　　傳統(tǒng)染色與ibidi方案染色

　　當(dāng)使用任何ibidi解決方案時(shí)，ibidi的免疫熒光染色方案比傳統(tǒng)方案要簡便快速的多。無需在松散的蓋玻片上生長細(xì)胞，細(xì)胞可直接在ibidi玻片上生長和染色。

　　用于免疫熒光應(yīng)用的各種ibidi產(chǎn)品

　　更多ibidi相關(guān)產(chǎn)品的免疫熒光實(shí)驗(yàn)應(yīng)用可查閱我們雷萌公眾號(hào)相關(guān)文章！

　　參考文獻(xiàn)

　　K.G. Zyner, A. Simeone, S.M. Flynn, et al. G-quadruplex DNA structures in human stem cells and differentiation. Nat Commun, 2022, 10.1038/s41467-021-27719-1

　　C. Xu, et al. NPTX2 promotes colorectal cancer growth and liver metastasis by the activation of the canonical Wnt/beta-catenin pathway via FZD6. Cell Death & Disease, 2019, 10.1038/s41419-019-1467-7

　　Kobayashi, T., et al. Principles of early human development and germ cell program from conserved model systems. Nature, 2017, 10.1038/nature22812

　　H. Tada et al. Porphyromonas gingivalis Gingipain-Dependently Enhances IL-33 Production in Human Gingival Epithelial Cells. PloS one, 2016, 10.1371/journal.pone.0152794

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倒置熒光顯微鏡下的免疫熒光細(xì)胞：探索微觀世界的奧秘

顯微鏡觀察免疫熒光細(xì)胞是一種重要的實(shí)驗(yàn)方法，用于研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸等成分的表達(dá)、功能和相互作用，目前，免疫熒光顯微鏡已經(jīng)成為生物學(xué)研究中不可或缺的工具之一。

在倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞時(shí)，需要選擇合適的顯微鏡參數(shù)，以確保觀察的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。例如，光源的種類、顯微鏡的分辨率、物鏡放大倍數(shù)和熒光通過率等因素。此外，在進(jìn)行免疫熒光顯微鏡觀察細(xì)胞時(shí)，需要選擇合適的熒光強(qiáng)度和熒光顏色，以避免對(duì)觀察結(jié)果的干擾。

倒置熒光顯微鏡MF52-N采用無限遠(yuǎn)光學(xué)設(shè)計(jì)和數(shù)顯LED熒光模塊，光路經(jīng)過深度優(yōu)化，能提供簡單易用的熒光激發(fā)和高質(zhì)量的相襯、熒光和明場成像，可選雙光路、一體供電、人走燈滅，廣泛用于細(xì)胞培養(yǎng)、生物制藥、醫(yī)療檢測等領(lǐng)域。

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