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問(wèn)答社區(qū)

求助:細(xì)胞膜蛋白免疫熒光染色問(wèn)題

心依然還在zz 2016-12-22 04:57:24 557  瀏覽
  •  

參與評(píng)論

全部評(píng)論(1條)

  • 詹小妞xl 2016-12-23 00:00:00
    細(xì)胞膜蛋白免疫熒光染色問(wèn)題 1、問(wèn):用免疫熒光方法做組織切片和培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)的蛋白,兩者操作過(guò)程有哪些不同? 參考見解:只是固定方法不同。細(xì)胞固定用甲醇,切片固定用多聚甲醛,而染色方法是一樣的。 2、問(wèn):近期要做免疫熒光雙標(biāo),不知哪位有免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)的詳細(xì)步驟及其注意事項(xiàng)? 參考見解:我正在做冰凍組織切片的免疫熒光雙染。我的經(jīng)驗(yàn)是: (1)選取一抗時(shí)要來(lái)源于兩種不同的動(dòng)物,我用的是來(lái)源于rabbit和rat的抗體,二抗則是不同熒光信號(hào)標(biāo)記的,我用的是donkey anti-rabbit-FITC(綠)和donkey anti-rat-Tex-Red(紅)。 (2)我的做法是兩種一抗(CHI抗體)同時(shí)孵育,然后兩種二抗同時(shí)孵育??贵w濃度、孵育時(shí)間要仔細(xì)摸索,我感覺(jué)一抗4度孵育過(guò)夜比較好,背景比較清晰。 (3)我的陽(yáng)性對(duì)照用的是陽(yáng)性組織切片,陰性對(duì)照則分別是家兔和大鼠的IgG,熒光標(biāo)記物對(duì)照是PBS+熒光標(biāo)記物。 (4)封閉血清與二抗來(lái)源動(dòng)物一致,我用的是10%的正常donkey血清。 (5)其余步驟同一般免疫熒光單標(biāo)操作。 3、問(wèn):本人擬做Brdu標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞免疫熒光,二抗為FITC標(biāo)記,想請(qǐng)教各位大俠: (1)抗體分裝和熒光顯微鏡觀察時(shí)是否一定要在暗室中進(jìn)行? (2)封片時(shí)是否用甘油緩沖液即可,還是用甘油和0.5mmol/L pH9.0-9.5的碳酸氫鹽緩沖液等量混合封片? (3)免疫酶染色中的3%過(guò)氧化氫及2N鹽酸是否還需要用? 參考見解: (1)你的二抗是用FITC標(biāo)記的,為避免熒光分解,分裝及熒光顯微鏡觀察時(shí)均要避光; (2)封片Z好用甘油加0.5mmol/L pH9.0-9.5的碳酸氫鹽緩沖液,后者能使玻片透明; (3)關(guān)于免疫酶染色,如果是用過(guò)氧化物酶做標(biāo)記,就必須用3%H2O2以去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶;2N鹽酸需要使用,目的是使DNA變性,讓Brdu抗體能夠充分地與已經(jīng)摻入的Brdu結(jié)合。 4、問(wèn):做間接法免疫熒光染色,如何設(shè)置對(duì)照? 參考見解:Z好是同一視野在未用熒光激發(fā)下進(jìn)行對(duì)照,看是否非特異性染色。 (1)空白對(duì)照:如果你做的是石蠟切片免疫組化,這個(gè)對(duì)照必須有,目的是看自發(fā)熒光,脫蠟后直接在熒光顯微鏡下觀察。 (2)陰性對(duì)照:標(biāo)本直接滴加二抗,呈陰性反應(yīng)。 (3)抗原對(duì)照:標(biāo)本加同種動(dòng)物的未免疫血清,以PBS沖洗后,在加抗免疫球蛋白熒光抗體。因未免疫動(dòng)物的血清中無(wú)特異性抗體,應(yīng)呈陰性反應(yīng)。 5、問(wèn):我做乳腺組織的免疫熒光染色,結(jié)果用激光共聚焦顯微鏡看很好:有陽(yáng)性信號(hào),陰性對(duì)照組也沒(méi)有熒光,但是拿到熒光顯微鏡下看,我的陰性對(duì)照組一片綠,像非特異性染色,到底哪個(gè)結(jié)果才是真實(shí)的呢? 參考見解:激光共聚焦顯微鏡的分辨率比普通熒光顯微鏡要高的多,出現(xiàn)上述現(xiàn)象首先要排除熒光顯微鏡的問(wèn)題,如是不是紫外燈泡壽命到期了或者別的原因,熒光顯微鏡沒(méi)有問(wèn)題,那就以共聚焦顯微鏡的結(jié)果為主。

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ibidi:免疫熒光染色故障排除指南

  01、故障排除

  免疫熒光染色是一種非常敏感的方法,需要大量的經(jīng)驗(yàn)和不斷優(yōu)化。方案中微小的變化可以顯著改變結(jié)果。如果遇到低信號(hào)、無(wú)信號(hào)或高背景,請(qǐng)參閱以下故障排除指南:

 

  高背景:

 

  02、ibidi解決方案

 

  用于倒置顯微鏡的具有蓋玻片底部的ibidi μ-Slides腔室載玻片和μ-Dishes培養(yǎng)皿有多種幾何形狀可供選擇,可滿足您對(duì)免疫細(xì)胞化學(xué)的任何特定需求。所有免疫熒光染色步驟都可以直接在載玻片或培養(yǎng)皿中進(jìn)行。


  ibidi通道載玻片的幾何形狀非常適合精確交換少量的培養(yǎng)基,這在免疫細(xì)胞化學(xué)染色過(guò)程中是必要的。此外,通道μ-Slides的蓋玻片底部無(wú)需額外的蓋玻片。

 

  在ibidi腔室載玻片中,帶有可移除的硅膠培養(yǎng)小室安裝在標(biāo)準(zhǔn)玻璃蓋玻片上,非常適合長(zhǎng)時(shí)間樣品保存。

 

 

  03、低信號(hào)或無(wú)信號(hào)

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免疫熒光細(xì)胞用什么顯微鏡觀察?

倒置熒光顯微鏡下的免疫熒光細(xì)胞:探索微觀世界的奧秘

顯微鏡觀察免疫熒光細(xì)胞是一種重要的實(shí)驗(yàn)方法,用于研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸等成分的表達(dá)、功能和相互作用,目前,免疫熒光顯微鏡已經(jīng)成為生物學(xué)研究中不可或缺的工具之一。

倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞時(shí),需要選擇合適的顯微鏡參數(shù),以確保觀察的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。例如,光源的種類、顯微鏡的分辨率、物鏡放大倍數(shù)和熒光通過(guò)率等因素。此外,在進(jìn)行免疫熒光顯微鏡觀察細(xì)胞時(shí),需要選擇合適的熒光強(qiáng)度和熒光顏色,以避免對(duì)觀察結(jié)果的干擾。

倒置熒光顯微鏡MF52-N采用無(wú)限遠(yuǎn)光學(xué)設(shè)計(jì)和數(shù)顯LED熒光模塊,光路經(jīng)過(guò)深度優(yōu)化,能提供簡(jiǎn)單易用的熒光激發(fā)和高質(zhì)量的相襯、熒光和明場(chǎng)成像,可選雙光路、一體供電、人走燈滅,廣泛用于細(xì)胞培養(yǎng)、生物制藥、醫(yī)療檢測(cè)等領(lǐng)域。


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來(lái)源:https://www.mshot.com/article/1810.html

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倒置熒光顯微鏡下的免疫熒光細(xì)胞

倒置熒光顯微鏡下的免疫熒光細(xì)胞:探索微觀世界的奧秘

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倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞時(shí),需要選擇合適的顯微鏡參數(shù),以確保觀察的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。例如,光源的種類、顯微鏡的分辨率、物鏡放大倍數(shù)和熒光通過(guò)率等因素。此外,在進(jìn)行免疫熒光顯微鏡觀察細(xì)胞時(shí),需要選擇合適的熒光強(qiáng)度和熒光顏色,以避免對(duì)觀察結(jié)果的干擾。

倒置熒光顯微鏡MF52-N采用無(wú)限遠(yuǎn)光學(xué)設(shè)計(jì)和數(shù)顯LED熒光模塊,光路經(jīng)過(guò)深度優(yōu)化,能提供簡(jiǎn)單易用的熒光激發(fā)和高質(zhì)量的相襯、熒光和明場(chǎng)成像,可選雙光路、一體供電、人走燈滅,廣泛用于細(xì)胞培養(yǎng)、生物制藥、醫(yī)療檢測(cè)等領(lǐng)域。

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