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  王建順happy 2018-02-20 21:55:04

  有限稀釋法是一種常用的克隆方法。 將需要再克隆的細(xì)胞株自培養(yǎng)孔內(nèi)吸出并作細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)出1mL的細(xì)胞數(shù)。 用HT培養(yǎng)液稀釋?zhuān)?使細(xì)胞濃度為50～60個(gè)/mL，于96孔培養(yǎng)板中每孔加0.1mL(五六個(gè)細(xì)胞/孔)。 接種2排，剩余細(xì)胞懸液用HT培養(yǎng)液作倍比稀釋?zhuān)俳臃N2排，如此類(lèi)推，直至使每孔含0.5～1個(gè)細(xì)胞。 培養(yǎng)7～10d后，選擇單個(gè)克隆生長(zhǎng)的陽(yáng)性孔再一次進(jìn)行克隆。一般需要如此重復(fù)3～5次，直至達(dá)100％陽(yáng)性孔率時(shí)即可，以確?？贵w由單個(gè)克隆所產(chǎn)生。 例如： 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞克隆化培養(yǎng)技術(shù)—有限稀釋法 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模? 1、掌握用有限稀釋法進(jìn)行細(xì)胞克隆化培養(yǎng)技術(shù)； 2、學(xué)會(huì)細(xì)胞克隆形成的辯觀察技能； 3、配合抗體分泌細(xì)胞篩選技術(shù)，確定抗體分泌細(xì)胞。 二、實(shí)驗(yàn)原理： 克隆化培養(yǎng)即單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，用有限稀釋法進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞克隆化培養(yǎng)，可以及時(shí)確定陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株，同時(shí)淘汰因發(fā)生染色體丟失或抗體的輕、重鏈基因分離而出現(xiàn)無(wú)抗體分泌陰性細(xì)胞株。 一般雜交瘤細(xì)胞需經(jīng)過(guò)52—3次反復(fù)克隆后，才能達(dá)到細(xì)胞陽(yáng)性率。 該辦法亦適用于一般細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)胞純化、突變細(xì)胞株的選擇，識(shí)別和分離。是細(xì)胞株的常用方法。 三、實(shí)驗(yàn)材料： 雜交瘤細(xì)胞、25毫升培養(yǎng)瓶、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（天津有機(jī)玻璃廠）、移液管（1毫升、5毫升、10毫升）、彎頭滴管、倒置顯微鏡、CO2培養(yǎng)箱、白細(xì)胞計(jì)數(shù)板、計(jì)數(shù)器、蓋玻片、防水筆、RPMI-1640、小牛血清、青鏈霉素、10毫升刻度離心管，00橡膠塞，飼養(yǎng)細(xì)胞（3-6×105/ml、見(jiàn)腹腔細(xì)胞的制備）。 四、實(shí)驗(yàn)步驟： 1、分裝了每孔0.1毫升腹腔細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（可提前24小時(shí)準(zhǔn)備就緒，置CO2培養(yǎng)箱中備用）； 2、自細(xì)胞培養(yǎng)瓶中收集長(zhǎng)勢(shì)良好的雜交瘤細(xì)胞（亦可自24孔培養(yǎng)板孔中收集），制成懸液。 3、按白細(xì)胞計(jì)數(shù)方法準(zhǔn)確計(jì)得細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)，一般在105/毫升左右。 4、取3支10毫升刻度離心管排列在超凈工作臺(tái)試管架上，先用無(wú)血清培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至103/毫升，再用含15%小牛血清的完全培養(yǎng)基稀釋到101/毫升細(xì)胞，即每0.1毫升1個(gè)細(xì)胞。 5、每孔0.1毫升細(xì)胞懸液。 6、置37℃5%CO2培養(yǎng)箱，4天后取出觀察，并在板蓋上打上標(biāo)記，做好記錄并統(tǒng)計(jì)結(jié)果。 7、繼續(xù)培養(yǎng)時(shí)，則在第4-5天更換1/2培養(yǎng)基，約第7-9天可以收獲培養(yǎng)液上清用于檢測(cè)抗體。并重復(fù)檢測(cè)1-2次。 8、選擇單克隆生長(zhǎng)孔，生長(zhǎng)良好，陽(yáng)性強(qiáng)者，轉(zhuǎn)移到24孔板再做克隆經(jīng)培養(yǎng)或擴(kuò)大培養(yǎng)。 五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 實(shí)驗(yàn)結(jié)果以總細(xì)胞孔（如96孔）中出現(xiàn)克隆孔統(tǒng)計(jì)出克隆百分率，并可進(jìn)一步按單細(xì)胞孔、雙細(xì)胞孔、多細(xì)胞孔分別計(jì)算出百分率。 六、注意事項(xiàng)： 1、注意無(wú)菌操作，一旦發(fā)現(xiàn)污染（孔）必須及時(shí)處理； 2、計(jì)數(shù)細(xì)胞要求準(zhǔn)確，稀釋量亦要準(zhǔn)確，否則將造成一孔多細(xì)胞克隆或克隆百分離太低； 3、在計(jì)數(shù)克隆出現(xiàn)率之前，不宜更換培養(yǎng)液，也不宜強(qiáng)烈振動(dòng)培養(yǎng)板； 4、做克隆化培養(yǎng)的小牛血清必須是優(yōu)質(zhì)血清； 5、若做克隆抗體檢測(cè)時(shí)，特別要保護(hù)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，防止細(xì)胞生長(zhǎng)不良甚至丟失。 七、說(shuō)明： 哺乳動(dòng)物細(xì)胞通過(guò)分離、稀釋接種，培養(yǎng)在適宜于單細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)液中，形成細(xì)胞克隆。運(yùn)用這項(xiàng)技術(shù)可以制作細(xì)胞成活曲線，即在接種相同數(shù)量細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中，加入不同濃度的化學(xué)藥品，或照以不同劑量的射線，觀察其對(duì)細(xì)胞的聽(tīng)見(jiàn)害程度。由此可以在哺乳類(lèi)細(xì)胞中進(jìn)行誘變?cè)囼?yàn)及分離突變細(xì)胞。

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