導(dǎo)論
乳糖操縱子（lacO）是一組埃希氏菌屬大腸桿菌基因， 負(fù)責(zé)細(xì)菌中的乳糖代謝。乳糖阻遏物對(duì)它的調(diào)節(jié)是分子生物學(xué)中一個(gè)被充分研究的系統(tǒng)。而乳糖阻遏物這一個(gè)DNA 結(jié)合蛋白（lacI）是控制乳糖操縱子的關(guān)鍵。 該系統(tǒng)的平衡解離常數(shù)（KD）通常估計(jì)在 nM 范圍內(nèi)。 

這種 lacO / lacI 系統(tǒng)通常在本科基因調(diào)控的生物化學(xué)和生物學(xué)課程中引入。更高級(jí)關(guān)于 lacO / lacI 的研究包括成像和染色質(zhì)編輯中的應(yīng)用。 

在更廣泛的領(lǐng)域里，SPR 對(duì)蛋白質(zhì)-DNA 復(fù)合物研究在理解基因表達(dá)調(diào)節(jié)途徑中有相當(dāng)重要的地位。
在這篇應(yīng)用筆記我們將分享蒙特利爾大學(xué)學(xué)術(shù)實(shí)驗(yàn)室如何使用 P4SPR 來確定 lacO / lacI 系統(tǒng)的結(jié)合強(qiáng)度（親和力，KD）。實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員通過易用的 P4SPR 和相應(yīng)的用戶界面來開發(fā) SPR 測(cè)定，以便于在本科實(shí)驗(yàn)課程中演示該生物系統(tǒng)。

圖1 乳糖操縱子與乳糖阻遏蛋白組合

實(shí)驗(yàn)裝置

系統(tǒng)設(shè)置

圖2 臺(tái)式P4SPR設(shè)置

USB 供電的 P4SPR 可以連接到筆記本電腦，通過 P4SPR控制軟件啟動(dòng)操作控制和數(shù)據(jù)記錄。易于使用的界面讓用戶可以輕松設(shè)置 P4SPR。 首先，把微流體單元（圖3）蓋在金傳感器芯片上并緊密固定在傳感器芯片腔中。然后在樣品和參比通道中注入溶液以穩(wěn)定基線。 S 形樣品通道具有 3 個(gè)平行的感應(yīng)區(qū)域，其可以提供一式三份的樣品測(cè)量以及與參考通道的一次控制測(cè)量。 通過透明通道可以在直接觀察在通道中是否有形成的氣 泡，以便立即清除而防止任何信號(hào)丟失。

圖3 P4SPR微流體單元

實(shí)驗(yàn)步驟

在達(dá)到基線穩(wěn)定后，將硫醇化的 LacO DNA 注入樣品通道。 固定化自發(fā)地造成強(qiáng)金-硫鍵形成，直到 SPR 表面飽和后產(chǎn)生平臺(tái)信號(hào)。 然后注射互補(bǔ)的 LacO 寡聚體以允許雜交。在結(jié)合測(cè)定之前徹底洗滌傳感器表面。 通過先前儲(chǔ)備的液蛋白溶液來制備 5, 20, 50, 100 和200nM 的溶液。 依次注入每種逐漸增加濃度的溶液， 并用其中的大量洗滌溶液和再生緩沖液孵育 10 分鐘，以從先前溶液中除去剩余的 LacI 蛋白。記錄來自所有4 個(gè)通道的數(shù)據(jù)，然后導(dǎo)出到 Excel 進(jìn)行進(jìn)一步的數(shù)據(jù)分析。
 
結(jié)果和討論
在該實(shí)驗(yàn)中，從樣品通道得到 3 條平行結(jié)合曲線。 對(duì)該信號(hào)進(jìn)行平均后從參考信道信號(hào)中減去來取得 SPR 信號(hào)相對(duì)于時(shí)間繪制（圖 5）。使用不同濃度的結(jié)合位移來建立結(jié)合等溫線，從而確定 KD（圖 6）。
計(jì)算的 KD 為 6.4±1.2nM，符合相關(guān)低濃度基于 LacI 的轉(zhuǎn)錄YZ蛋白的文獻(xiàn)報(bào)道值1。值得注意的是，與已發(fā)表論文中使用的 DNA 結(jié)合分析相比，SPR 分析不需要任何 DNA 放射性標(biāo)記，并且可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)結(jié)合相互作用。

P4SPR 優(yōu)勢(shì)
P4SPR 獨(dú)特的模塊式，便攜和多通道設(shè)計(jì)使其成為用于藥物發(fā)現(xiàn)，生物/傳感和系統(tǒng)集成應(yīng)用的靈活臺(tái)式 SPR 工具。 它幾乎不需要樣品制備，使得系統(tǒng)設(shè)置快速簡(jiǎn)單，同時(shí)節(jié)省了用戶在純化試劑盒和試劑上的成本。此外，P4SPR 利用薄膜 SPR 的高靈敏度和更深的穿透深度來準(zhǔn)確測(cè)量和結(jié)合的親和力。

總結(jié)
P4SPR 成功地展出乳糖操縱子 DNA 與其阻遏蛋白的結(jié)合相互作用，并且數(shù)據(jù)可從之前發(fā)表的文獻(xiàn)驗(yàn)證。 本科生可從該實(shí)驗(yàn)熟悉該 SPR 技術(shù)及其在監(jiān)測(cè)生物分子相互作用中的應(yīng)用。 此外，P4SPR 系統(tǒng)也可考察其他生物系統(tǒng)，如 DNA-DNA，RNA 以及適體對(duì)，可以幫助科研人員更好地了解結(jié)合并揭示生物通路中的功能。
 
致謝
我們要感謝 Philipe Lampron，Shona Teijeiro 和蒙特利爾生物化學(xué)大學(xué)的 SébastienTruche 開發(fā)該化驗(yàn)。
 
關(guān)于 Affinité Instruments
Affinité Instruments 成立于 2015 年，是一個(gè)從蒙特利爾大學(xué)衍生的企業(yè)。Affinité Instruments 的創(chuàng)始人在 SPR 領(lǐng)域積累了十多年豐富的研究結(jié)果的知識(shí)，并通過多元化的商業(yè)，科學(xué)和工程領(lǐng)域經(jīng)驗(yàn)將創(chuàng)新的 SPR 技術(shù)商業(yè)化。

參考文獻(xiàn)
1 Tungtur et al. Reconciling in vitro and in vivo activities of engineered, LacI3 based repressor proteins:Contributions of DNA looping and 4 operator sequence variation. doi: https://doi.org/10.1101/477893

導(dǎo)論
乳糖操縱子（lacO）是一組埃希氏菌屬大腸桿菌基因， 負(fù)責(zé)細(xì)菌中的乳糖代謝。乳糖阻遏物對(duì)它的調(diào)節(jié)是分子生物學(xué)中一個(gè)被充分研究的系統(tǒng)。而乳糖阻遏物這一個(gè)DNA 結(jié)合蛋白（lacI）是控制乳糖操縱子的關(guān)鍵。 該系統(tǒng)的平衡解離常數(shù)（KD）通常估計(jì)在 nM 范圍內(nèi)。這種 lacO / lacI 系統(tǒng)通常在本科基因調(diào)控的生物化學(xué)和生物學(xué)課程中引入。更高級(jí)關(guān)于 lacO / lacI 的研究包括成像和染色質(zhì)編輯中的應(yīng)用。 

在更廣泛的領(lǐng)域里，SPR 對(duì)蛋白質(zhì)-DNA 復(fù)合物研究在理解基因表達(dá)調(diào)節(jié)途徑中有相當(dāng)重要的地位。
在這篇應(yīng)用筆記我們將分享蒙特利爾大學(xué)學(xué)術(shù)實(shí)驗(yàn)室如何使用 P4SPR 來確定 lacO / lacI 系統(tǒng)的結(jié)合強(qiáng)度（親和力，KD）。實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員通過易用的 P4SPR 和相應(yīng)的用戶界面來開發(fā) SPR 測(cè)定，以便于在本科實(shí)驗(yàn)課程中演示該生物系統(tǒng)。

圖1 乳糖操縱子與乳糖阻遏蛋白組合

實(shí)驗(yàn)裝置

系統(tǒng)設(shè)置

圖2 臺(tái)式P4SPR設(shè)置

USB 供電的 P4SPR 可以連接到筆記本電腦，通過 P4SPR控制軟件啟動(dòng)操作控制和數(shù)據(jù)記錄。易于使用的界面讓用戶可以輕松設(shè)置 P4SPR。 首先，把微流體單元（圖3）蓋在金傳感器芯片上并緊密固定在傳感器芯片腔中。然后在樣品和參比通道中注入溶液以穩(wěn)定基線。 S 形樣品通道具有 3 個(gè)平行的感應(yīng)區(qū)域，其可以提供一式三份的樣品測(cè)量以及與參考通道的一次控制測(cè)量。 通過透明通道可以在直接觀察在通道中是否有形成的氣 泡，以便立即清除而防止任何信號(hào)丟失。

圖3 P4SPR微流體單元

實(shí)驗(yàn)步驟

在達(dá)到基線穩(wěn)定后，將硫醇化的 LacO DNA 注入樣品通道。 固定化自發(fā)地造成強(qiáng)金-硫鍵形成，直到 SPR 表面飽和后產(chǎn)生平臺(tái)信號(hào)。 然后注射互補(bǔ)的 LacO 寡聚體以允許雜交。在結(jié)合測(cè)定之前徹底洗滌傳感器表面。 通過先前儲(chǔ)備的液蛋白溶液來制備 5, 20, 50, 100 和200nM 的溶液。 依次注入每種逐漸增加濃度的溶液， 并用其中的大量洗滌溶液和再生緩沖液孵育 10 分鐘，以從先前溶液中除去剩余的 LacI 蛋白。記錄來自所有4 個(gè)通道的數(shù)據(jù)，然后導(dǎo)出到 Excel 進(jìn)行進(jìn)一步的數(shù)據(jù)分析。
 
結(jié)果和討論
在該實(shí)驗(yàn)中，從樣品通道得到 3 條平行結(jié)合曲線。 對(duì)該信號(hào)進(jìn)行平均后從參考信道信號(hào)中減去來取得 SPR 信號(hào)相對(duì)于時(shí)間繪制（圖 5）。使用不同濃度的結(jié)合位移來建立結(jié)合等溫線，從而確定 KD（圖 6）。
計(jì)算的 KD 為 6.4±1.2nM，符合相關(guān)低濃度基于 LacI 的轉(zhuǎn)錄YZ蛋白的文獻(xiàn)報(bào)道值1。值得注意的是，與已發(fā)表論文中使用的 DNA 結(jié)合分析相比，SPR 分析不需要任何 DNA 放射性標(biāo)記，并且可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)結(jié)合相互作用。

P4SPR 優(yōu)勢(shì)
P4SPR 獨(dú)特的模塊式，便攜和多通道設(shè)計(jì)使其成為用于藥物發(fā)現(xiàn)，生物/傳感和系統(tǒng)集成應(yīng)用的靈活臺(tái)式 SPR 工具。 它幾乎不需要樣品制備，使得系統(tǒng)設(shè)置快速簡(jiǎn)單，同時(shí)節(jié)省了用戶在純化試劑盒和試劑上的成本。此外，P4SPR 利用薄膜 SPR 的高靈敏度和更深的穿透深度來準(zhǔn)確測(cè)量和結(jié)合的親和力。

總結(jié)
P4SPR 成功地展出乳糖操縱子 DNA 與其阻遏蛋白的結(jié)合相互作用，并且數(shù)據(jù)可從之前發(fā)表的文獻(xiàn)驗(yàn)證。 本科生可從該實(shí)驗(yàn)熟悉該 SPR 技術(shù)及其在監(jiān)測(cè)生物分子相互作用中的應(yīng)用。 此外，P4SPR 系統(tǒng)也可考察其他生物系統(tǒng)，如 DNA-DNA，RNA 以及適體對(duì)，可以幫助科研人員更好地了解結(jié)合并揭示生物通路中的功能。
 
致謝
我們要感謝 Philipe Lampron，Shona Teijeiro 和蒙特利爾生物化學(xué)大學(xué)的 SébastienTruche 開發(fā)該化驗(yàn)。
 

參考文獻(xiàn)
1 Tungtur et al. Reconciling in vitro and in vivo activities of engineered, LacI3 based repressor proteins:Contributions of DNA looping and 4 operator sequence variation. doi: https://doi.org/10.1101/477893

      《Cell》期刊發(fā)表這一篇題為“Changes of Cell Biochemical States Are Revealed in Protein Homomeric Complex Dynamics”的文章，揭示了二甲雙胍在細(xì)胞內(nèi)的作用細(xì)節(jié)，進(jìn)一步解釋了二甲雙胍在預(yù)防各種慢性疾病上的潛力，包括癌癥。

       來自蒙特利爾大學(xué)、倫敦Francis Crick研究所的科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍會(huì)讓細(xì)胞呈現(xiàn)出類似于缺乏鐵元素的狀態(tài)。這種模擬“鐵饑餓”的方式可以促進(jìn)細(xì)胞更好地?cái)z取、使用葡萄糖，從而實(shí)現(xiàn)了防治效果。

http://www.giant-bio.com/home-productinfo-id-8.html

模擬缺鐵，促進(jìn)糖代謝

      蒙特利爾大學(xué)的生物化學(xué)教授Stephen Michnick帶領(lǐng)團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種新技術(shù)——hdPCA，能夠以非侵入性的廉價(jià)方式，快速預(yù)測(cè)和確認(rèn)藥物是如何影響細(xì)胞的。

       他們發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍對(duì)于細(xì)胞內(nèi)鐵的分布有著***的影響，進(jìn)而導(dǎo)致基本的生化過程發(fā)生變化。早前已有研究表明鐵代謝和糖尿病之間存在關(guān)聯(lián)，但是卻沒有直接的證據(jù)?；?**新的發(fā)現(xiàn)，研究人員推測(cè)，二甲雙胍引發(fā)的葡萄糖代謝可能依賴于模擬缺鐵引發(fā)的化學(xué)反應(yīng)。

      研究人員強(qiáng)調(diào)，仍然需要進(jìn)一步的細(xì)胞和動(dòng)物試驗(yàn)，以確定二甲雙胍模擬鐵饑餓對(duì)葡萄糖代謝的重要性。這將有利于更好地利用這種機(jī)制來改善糖尿病治。

      作為治二型糖尿病的一線藥物，二甲雙胍的療效已經(jīng)得到了毫無爭(zhēng)議的認(rèn)可。2017年，《Nature Medicine》期刊發(fā)文揭示了二甲雙胍的降糖作用可能與改變腸道細(xì)菌組成有關(guān)。他們發(fā)現(xiàn)，通過降低肝臟中葡萄糖的數(shù)量來治糖尿病并不是二甲雙胍的全部機(jī)制。

      這篇研究指明，二甲雙胍至少在一定程度上通過促進(jìn)腸道細(xì)菌（如Akkermansia）的生長(zhǎng)來發(fā)揮作用。這為患者通過改變飲食來調(diào)整腸道菌群結(jié)構(gòu)，***終獲得降糖效益提供了新的線索。

除了影響腸道菌群，來自西北大學(xué)的Navdeep Chandel教授曾證實(shí)，二甲雙胍可以減緩線粒體代謝，進(jìn)而阻止癌癥的生長(zhǎng)。

RNA提取磁珠屬于納米生物磁珠的一種，主要作用是用于核酸提取過程中的RNA提取，粒徑分布在500nm左右，是洛陽吉恩特生物自主研發(fā)生產(chǎn)的高分子納米磁性微球，該磁珠懸浮時(shí)間長(zhǎng)，磁響應(yīng)時(shí)間迅速，對(duì)DNA甲基化過程中的提取環(huán)節(jié)提供良好的支持，可明顯縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提高實(shí)驗(yàn)效率，并在提取結(jié)果上保持穩(wěn)定，配合核酸提取儀，更能實(shí)現(xiàn)快速的RNA提取。