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  真真切切ii 2017-03-10 00:00:00

  普通的測序不能找到甲基化位點(diǎn)。 這里有幾種常用的找甲基化位點(diǎn)的測序方法： diyi種是重亞硫酸鹽測序。重亞硫酸鹽使DNA中未發(fā)生甲基化的胞嘧啶脫氨基轉(zhuǎn)變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變，行PCR擴(kuò)增(引物設(shè)計(jì)時盡量避免有CpG，以免受甲基化因素的影響)所需片段，則尿嘧啶全部轉(zhuǎn)化成胸腺嘧啶。Z后，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，并且與未經(jīng)處理的序列比較，判斷是否CpG位點(diǎn)發(fā)生甲基化。此方法一種可靠性及精確度很高的方法，能明確目的片段中每一個CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。在尋找有意義的關(guān)鍵性CpG位點(diǎn)上，有其他方法無法比擬的優(yōu)點(diǎn)。測序法以CpG島兩側(cè)不含CpG點(diǎn)的一段序列為引物配對區(qū)，所以能夠同時擴(kuò)增出甲基化和非甲基化靶序列。它的不足是耗費(fèi)時間和耗資過多，至少要測序10個以上的克隆才能獲得可靠數(shù)據(jù)，需要大量的克隆及質(zhì)粒提取測序，過程較為繁瑣、昂貴。 第二種甲基化DNA免疫共沉淀MeDIP-Seq（Methylated DNA Immunoprecipitation Sequencing）測序，是基于抗體富集原理進(jìn)行測序的全基因組甲基化檢測技術(shù)，采用甲基化DNA免疫共沉淀技術(shù)，通過5'-甲基胞嘧啶抗體特異性富集基因組上發(fā)生甲基化的DNA片段，然后通過高通量測序可以在全基因組水平上進(jìn)行高精度的CpG密集的高甲基化區(qū)域研究。MeDIP-Seq（Methylated DNA Immunoprecipitation Sequencing）測序是基于抗體富集原理進(jìn)行測序的全基因組甲基化檢測技術(shù)，采用甲基化DNA免疫共沉淀技術(shù)，通過5'-甲基胞嘧啶抗體特異性富集基因組上發(fā)生甲基化的DNA片段，然后通過高通量測序可以在全基因組水平上進(jìn)行高精度的CpG密集的高甲基化區(qū)域研究。 第三種是三代測序技術(shù)，采用pacbio測序儀的SMRT技術(shù)，采用的是對DNA聚合酶的工作狀態(tài)進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測的方法。DNA聚合酶催化熒光標(biāo)記的核苷酸摻入到互補(bǔ)的核酸鏈中。核苷酸的摻入被檢測成熒光脈沖，依據(jù)其顏色鑒定出核苷酸。當(dāng)聚合酶切斷連接在核苷酸末端的熒光基團(tuán)時，脈沖終止。熒光脈沖的到達(dá)時間和持續(xù)時間產(chǎn)生了關(guān)于聚合酶動力學(xué)的信息，從而允許直接檢測DNA模板鏈中的修飾核苷酸，包括N6-甲基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶和5-羥甲基胞嘧啶。

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