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  漢共操耗侄障說 2011-01-07 00:00:00

  一種全新的DNA甲基化研究方法——Pyrosequencing技術(shù) DNA甲基化是一種表觀遺傳修飾，它是由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyl-transferase， Dnmt）催化S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，將胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基胞嘧啶（mC）的一種反應(yīng)，在真核生物DNA中，5-甲基胞嘧啶是唯yi存在的化學(xué)性修飾堿基。CG二核苷酸是Z主要的甲基化位點，它在基因組中呈不均勻分布，存在高甲基化、低甲基化和非甲基化的區(qū)域，在哺乳動物中mC約占C總量的2－7％。一般說來，DNA的甲基化會YZ基因的表達。DNA的甲基化對維持染色體的結(jié)構(gòu)、X染色體的失活、基因印記和腫瘤的發(fā)SF展都起重要的作用。 CpG雙核苷酸在人類基因組中的分布很不均一，而在基因組的某些區(qū)段，CpG保持或高于正常概率，這些區(qū)段被稱作CpG島。CpG島主要位于基因的啟動子和diyi外顯子區(qū)域，約有60％以上基因的啟動子含有CpG島。 CpG甲基化的研究在腫瘤的研究中有著非常主要的地位。通過基因啟動子區(qū)及附近區(qū)域CpG島胞嘧啶的甲基化可以在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)基因的表達，從而引起相應(yīng)基因沉默，去甲基化又可恢復(fù)其表達。DNA甲基化在生理情況下就參與了控制基因的時空表達，在腫瘤發(fā)生時，腫瘤細胞全基因組低甲基化是一個重要特征。腫瘤細胞基因組甲基化的程度與正常細胞相比僅為20-60% ， 同時伴有局部區(qū)域基因的高甲基化，包括腫瘤YZ基因、YZ腫瘤轉(zhuǎn)移和浸潤的基因、細胞周期調(diào)節(jié)基因、DNA修復(fù)基因、血管形成YZ基因等。但是目前研究手段的局限，限制了DNA甲基化的廣泛研究。 近年來，研究者不斷探索定性及定量檢測單個或多個甲基化位點的方法，但由于甲基化多態(tài)性區(qū)域存在的密度很高，所以對于延伸反應(yīng)其引物的位置很難設(shè)計。Pyrosequencing技術(shù)作為一種新的序列分析技術(shù)，能夠快速地檢測甲基化的頻率，對樣品中的甲基化位點進行定性及定量檢測，為甲基化研究提供了新的途徑。 從原理上來看，Pyrosequencing是一種通過合成方法進行序列分析的方法，它通過核苷酸和模板結(jié)合后釋放的焦磷酸引發(fā)酶級聯(lián)反應(yīng)，促使熒光素發(fā)光并進行檢測。這項技術(shù)曾經(jīng)被用作單核苷酸多態(tài)性（SNP）的基因型和單倍型的檢測，以及細菌和病毒的鑒定和分型研究。這項技術(shù)的一個主要特點是在Pyrogarm™軟件上顯示的峰值高度來自于序列分析的原始數(shù)據(jù)，通過峰值的高度可以精確的檢測混合DNA模板中等位基因的頻率。 目前甲基化研究方面，很多甲基化定量分析的報道采用亞硫酸氫鹽處理甲基化樣本，并用混合的PCR產(chǎn)物 作為校正。其主要原理是：亞硫酸氫鹽可以將沒有甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而在適當?shù)膶嶒灄l件下甲基化的胞嘧啶保持不變。因而，用它處理樣本后，再進行PCR擴增，甲基化的位點可以被當作一個C/T的SNP來處理，它的基因頻率為0－100％。在此，我們給大家介紹一個研究人員使用Pyrosequencing技術(shù)分析并精確定量DNA甲基化水平的例子。 研究者在一個Pyrosequencing反應(yīng)中同時檢測了6個甲基化位點。這種方法同樣可以用于石蠟包埋的組織，并且具有較高的重復(fù)性和精確性。實驗選擇谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶π（GSTP1）轉(zhuǎn)錄啟動位點的CpG島進行檢測。這些位點在正常前列腺組織中是非甲基化的，而在腫瘤樣本中高甲基化。通過PCR擴增一個包含17個甲基化多態(tài)位點140bp的片段，并用4個測序引物研究其中15個位點（Table 1）。使用在線的SNP測序引物設(shè)計軟件（Pyrosequencing AB）設(shè)計測序引物，其中一些甲基化多態(tài)性位點用Z可能的堿基所代替，以減少計算的數(shù)量。再通過人工檢測測序引物可能存在的錯配。此外，同時在PSQ 96MA DNA分析儀上運行空白對照，扣除由測序引物、生物素標記的引物或是模板引起的背景。 PCR引物設(shè)計完全與模板相匹配，不覆蓋任何甲基化多態(tài)性區(qū)域。使用10ng亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的DNA樣本或是10 fmol純化的PCR產(chǎn)物，10 pmol 正向（5’-GTGATTTAGTATTGG-3’）和反向（5’-biotin-AACTCTAAACCCCATC-3’）引物擴增GSTP1轉(zhuǎn)錄啟動位點的基因片段，擴增片段長度為144bp。反應(yīng)體系為60 mM Tris-SO4， pH 8.9， 18 mM (NH4)2SO4， 1 mM MgSO4， 200 μM dNTPs，以及3 U Platinum Taq DNA高保真聚合酶，終體積為50μL。PCR循環(huán)設(shè)置：首先在95℃下變性4分鐘，然后在95℃ 30S，50℃ 45S以及72℃ 20S條件下重復(fù)50個循環(huán)，Z后一步延伸步驟在72℃下4分鐘，中止反應(yīng)。PCR反應(yīng)在Eppendorf的Mastercycler 96 哺乳動物基因組中，DNA甲基化是指CpG二核苷酸中的胞嘧啶第5位碳原子被甲基化. DNA甲基化是一種基因外修飾，不改變DNA的一級結(jié)構(gòu); 他在細胞正常發(fā)育、基因表達模式以及基因組穩(wěn)定性中起著至關(guān)重要的作用. 全基因組低甲基化，維持甲基化模式酶的調(diào)節(jié)失控和正常非甲基化CpG島的高甲基化是人類腫瘤中普遍存在的現(xiàn)象. DNA高甲基化是導(dǎo)致抑癌基因失活的又一個機制.

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