在高效液相色譜應(yīng)用的初期，人們認(rèn)為它會(huì)成為氣相色譜的補(bǔ)充方法，然而今天HPLC在藥物分析中幾乎完全取代了氣相色譜。與其他方法相比，在色譜過(guò)程中可能會(huì)改變流動(dòng)極性的液體流動(dòng)相的應(yīng)用以及根據(jù)所測(cè)試物質(zhì)的特性對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行的所有其他修改，在分離過(guò)程中具有很大的優(yōu)勢(shì)。

       任何藥物的高效液相色譜 (HPLC) 分析的目的是確認(rèn)藥物的特性并提供定量結(jié)果。還可以用于通過(guò)藥物注冊(cè)前調(diào)查期間的生物醫(yī)學(xué)和治療研究，進(jìn)一步了解人體的正常和疾病過(guò)程。生物體液（尤其是血漿、血清或尿液）中藥物和代謝物的分析是高效液相色譜最苛刻但最常見的用途之一。血液、血漿或血清含有十種濃度遠(yuǎn)高于分析物濃度的大量?jī)?nèi)源性化合物。分析物濃度通常很低，對(duì)于藥物而言，內(nèi)源性化合物有時(shí)在結(jié)構(gòu)上與待測(cè)藥物非常相似。藥物與血漿蛋白的結(jié)合也可能發(fā)生，這會(huì)減少所測(cè)量的游離化合物的量。

       液相色譜技術(shù)對(duì)于研究小分子和大分子之間的相互作用非常方便，特別是研究藥物-蛋白質(zhì)結(jié)合。部分研發(fā)人員已經(jīng)使用固定化人血清白蛋白相來(lái)研究苯二氮卓類藥物、華法林、布洛芬等藥物的相互作用。使用這個(gè)階段作為體內(nèi)發(fā)生的相互作用的模型可以更進(jìn)一步。通過(guò)在流動(dòng)相中添加藥物，可以研究一種藥物與人血清白蛋白的相互作用如何受到另一種藥物的影響。

       液相色譜還廣泛用于對(duì)藥物制劑進(jìn)行的藥物溶出度研究，以評(píng)估進(jìn)入胃時(shí)制劑中藥物物質(zhì)的可用性。將制劑攪拌，溶解浴通常含有旨在模擬胃中條件的水性緩沖液，然后在設(shè)定的時(shí)間段內(nèi)對(duì)水性緩沖液取樣并分析藥物濃度。藥物穩(wěn)定性研究至關(guān)重要，因?yàn)樾枰苊鉂撛诘挠卸窘到猱a(chǎn)物。在此類研究中，有必要證明制劑的藥物含量沒(méi)有隨時(shí)間變化。此外，如果確實(shí)發(fā)生降解，則有必要識(shí)別和量化降解產(chǎn)物?，F(xiàn)階段在很多國(guó)家的藥典中都是使用高效液相色譜法代替化學(xué)和許多儀器方法來(lái)控制藥物。

      深圳市恒譜生科學(xué)儀器有限公司是致力于高品質(zhì)色譜耗材配件的研發(fā)制造OEM為一體的生產(chǎn)企業(yè)，專業(yè)研發(fā)色譜柱、空柱管總成、保護(hù)柱、在線過(guò)濾器、篩板、溶劑過(guò)濾器、管路接頭等。 我們不斷地提高研發(fā)制備能力、優(yōu)化管理體系,以嚴(yán)苛的制程管控、優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品服務(wù)，為各色譜儀器廠家和耗材供應(yīng)商提供更優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品及更有力的服務(wù)支持，與大家攜手共創(chuàng)美好未來(lái)!

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生物大分子藥物目前主要包括治 療性蛋白藥物與核酸藥物等，隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展，生物大分子已被普遍用以治 療腫瘤、本身免疫系統(tǒng)疾病和遺傳代謝病等多種疾病。生物治 療藥物在臨床和商業(yè)上的成功引起了行業(yè)內(nèi)對(duì)其開發(fā)的日益重視，需要高質(zhì)量的生物分析來(lái)支持這些藥物的開發(fā)。

與常規(guī)藥物一樣，評(píng)估大分子藥物的安全性和有效性需要徹底了解其藥代動(dòng)力學(xué)（PK）、藥效學(xué)（PD）、毒代動(dòng)力學(xué)（TK）以及免疫原性等特征。在藥物與機(jī)體相互作用中，PK是研究機(jī)體對(duì)藥物的處置作用，而PD和TK是分別研究藥物對(duì)機(jī)體有益/有害的效應(yīng)。PD/PK和PK/TK的相互關(guān)系是藥物藥理學(xué)評(píng)價(jià)的核心。FDA、NMPA等監(jiān)管機(jī)構(gòu)要求藥物進(jìn)入臨床前必須證明其有效性和安全性，臨床前和臨床研究均需要研究藥物的PK，同時(shí)FDA建議對(duì)免疫原性風(fēng)險(xiǎn)檢測(cè)最 好在IND階段和臨床I期開展。因此，建立好的PD/PK/TK等生物分析方案對(duì)于大分子藥物的臨床前及臨床分析評(píng)價(jià)極為重要。

與小分子藥物相比，大分子藥物具有分子量大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、細(xì)胞外基質(zhì)不容易透過(guò)、使用量低、身體易溶解等特性，其生物分析充滿挑戰(zhàn)。

生物大分子藥物與傳統(tǒng)小分子藥物的藥代動(dòng)力學(xué)

特征比較（藥學(xué)進(jìn)展 ，2018年8期 ）

傳統(tǒng)的生物分析方法通常依賴于基于小分子檢測(cè)的液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)和基于生物制劑的配體結(jié)合分析（ligand-binding assay，LBA)），目前這兩種方法也用于抗體等生物藥的生物分析中。在現(xiàn)在的創(chuàng)新藥物中，還有mRNA、病毒載體、細(xì)胞治 療產(chǎn)品等，這些藥物本質(zhì)上并非蛋白質(zhì)藥物，因此qPCR、流式細(xì)胞術(shù)、成像技術(shù)等手段也越來(lái)越多地用于生物藥的生物分析中。

01、基于配體結(jié)合分析

生物分析中基于配體結(jié)合分析LBA是一種常用的分析工具，用于根據(jù)與其他生物分子的相互結(jié)合作用（binding interaction），定量測(cè)定生物分子（目標(biāo)分析物，Analyte）在生物體液中的濃度，主要包括酶聯(lián)免疫(ELISA)等。

目前ELISA是生物制藥行業(yè)使用最廣泛的配體結(jié)合式（LBA）檢測(cè)平臺(tái)，它一直以來(lái)都是蛋白質(zhì)定量分析最常用的技術(shù)，現(xiàn)在大多數(shù)生物標(biāo)志物的商業(yè)檢測(cè)試劑盒都是基于ELISA的。這項(xiàng)技術(shù)對(duì)于某些臨床前生物分析的應(yīng)用仍然很有吸引力，比如血清單克隆抗體的PK。但是ELISA操作復(fù)雜、測(cè)試運(yùn)行時(shí)間長(zhǎng)，采用自動(dòng)化平臺(tái)可縮短分析人員操作的時(shí)間， 提高工作效率。

丹納赫生命科學(xué)旗下貝克曼庫(kù)爾特的Biomek i7自動(dòng)化工作站結(jié)合美谷分子儀器的SpectraMax i3 多功能酶標(biāo)儀，可以自動(dòng)化地對(duì)樣本進(jìn)行高通量的ELISA操作，大大避免實(shí)驗(yàn)誤差及重復(fù)的人工勞動(dòng)。

自動(dòng)化工作站進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)流程

自動(dòng)化工作站進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

02、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)LC-MS/MS

與LBA 相比，LC-MS/MS 在生物分析中的優(yōu)勢(shì)在于可以提供快速的方法開發(fā)和驗(yàn)證、高特異性和高重現(xiàn)性，還可以實(shí)現(xiàn)多種分析物同時(shí)定量。另外，LC-MS/MS 方法也更容易在不同的分析物類別和基質(zhì)之間轉(zhuǎn)移。但是靈敏度、樣品制備、方法開發(fā)和定量準(zhǔn)確度相關(guān)的難題也亟需解決。

丹納赫生命科學(xué)旗下SCIEX開發(fā)了一種通用的混合LBA和LC-MS/MS兩種技術(shù)的工作流程，該工作流程結(jié)合了這兩種技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，可用于蛋白質(zhì)藥物的PK分析。該方法檢測(cè)阿達(dá)木單抗在小鼠血漿中的濃度，先用磁珠方法進(jìn)行免疫親和性樣品的制備，然后將阿巴利單抗標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行消化后進(jìn)入TripleTOF? MS系統(tǒng)進(jìn)行肽圖譜分析，用以選擇蛋白質(zhì)定量的特征性肽段。在QTRAP 6500+系統(tǒng)進(jìn)行定量分析后，50 到 10000 ng/mL 的線性關(guān)系可達(dá)0.99763，定量限為50 ng/mL。

LC-MS/MS方法的前處理流程

阿達(dá)木單抗的提取離子色譜圖   

SCIEX QTRAP? 6500+ 系統(tǒng)

03、qPCR技術(shù)

qPCR法是常用的分析核酸藥物表達(dá)量的一種方法，其定量下限可以達(dá)到pg/mL甚至fg/mL，這可以極大增強(qiáng)藥物在體內(nèi)暴露的檢測(cè)時(shí)間。此外，RT-qPCR使用的樣本量極少，只需要幾微升血漿樣本或1毫克組織即可滿足分析需求，減少了對(duì)珍貴樣本的使用，而且能夠使用384孔板實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本的高通量分析。然而獲得信號(hào)特異、低背景的qPCR結(jié)果也非易事，丹納赫生命科學(xué)旗下IDT埃德特的雙淬滅熒光探針，在靠近報(bào)告基團(tuán)9bp左右的位置增加一個(gè)中間淬滅基團(tuán)，為FRET作用中提供了一個(gè)能量的“中轉(zhuǎn)站”，拉近了能量傳遞中每個(gè)基團(tuán)間的距離，從而提高了熒光淬滅率降低了背景信號(hào)。

IDT 雙淬滅熒光探針示意圖

（藍(lán)色序列片段即為雙淬滅熒光探針）

在過(guò)去20年中，新型治 療方式的出現(xiàn)改變了生物分析領(lǐng)域的現(xiàn)狀，導(dǎo)致了一系列技術(shù)的發(fā)展和成熟。在發(fā)現(xiàn)階段以及藥物開發(fā)的臨床前和臨床階段，健全的生物分析方法非常重要，這將有助于開發(fā)更安全、更有效的藥物，同時(shí)減少開發(fā)的時(shí)間和成本。丹納赫生命科學(xué)一系列先進(jìn)的生物分析工具和方法能夠有效幫助應(yīng)對(duì)創(chuàng)新藥物復(fù)雜結(jié)構(gòu)和不同作用機(jī)制對(duì)PK、PD和免疫原性評(píng)估提出的重大挑戰(zhàn)。