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  三灌墓?jié)n頌Mc8 2017-10-04 15:38:31

  常用紫外分光光度法測定蛋白質含量。 以下引用： 6種方法測定蛋白質含量 一、微量凱氏（kjeldahl）定氮法 樣品與濃硫酸共熱。含氮有機物即分解產(chǎn)生氨（消化），氨又與硫酸作用，變成硫酸氨。經(jīng)強堿堿化使之分解放出氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據(jù)此酸液被中和的程度可計算得樣品之氮含量。若以甘氨酸為例，其反應式如下： nh2ch2cooh+3h2so4——2co2+3so2+4h2o+nh3 (1) 2nh3+h2so4——(nh4)2so4 (2) (nh4)2so4+2naoh——2h2o+na2so4+2nh3 (3) 反應（1）、(2)在凱氏瓶內(nèi)完成，反應（3）在凱氏蒸餾裝置中進行。 為了加速消化，可以加入cuso4作催化劑，k2so4以提高溶液的沸點。收集氨可用硼酸溶液，滴定則用強酸。實驗和計算方法這里從略。 計算所得結果為樣品總氮量，如欲求得 樣品中蛋白含量，應將總氮量減去非蛋白 氮即得。如欲進一步求得樣品中蛋白質的含量，即用樣品中蛋白氮乘以6．25即得。 二、雙縮脲法（biuret法） （一）實驗原理 雙縮脲（nh3conhconh3）是兩個分子脲經(jīng)180℃左右加熱，放出一個分子氨后得到的產(chǎn)物。在強堿性溶液中，雙縮脲與cuso4形成紫色絡合物，稱為雙縮脲反應。凡具有兩個酰胺基或兩個直接連接的肽鍵，或能過一個中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應。 紫色絡合物顏色的深淺與蛋白質濃度成正比，而與蛋白質分子量及氨基酸成分無關，故可用來測定蛋白質含量。測定范圍為1-10mg蛋白質。干擾這一測定的物質主要有：硫酸銨、tris緩沖液和某些氨基酸等。 此法的優(yōu)點是較快速 ，不同的蛋白質產(chǎn)生顏色的深淺相近，以及干擾物質少。主要的缺點是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于需要快速，但并不需要十分精確的蛋白質測定。 （二）試劑與器材 1. 試劑： （1）標準蛋白質溶液：用標準的結晶牛血清清蛋白（bsa）或標準酪蛋白，配制成10mg/ml的標準蛋白溶液，可用bsa濃度1mg/ml的a280為0.66來校正其純度。如有需要，標準蛋白質還可預先用微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，計算出其純度，再根據(jù)其純度，稱量配制成標準蛋白質溶液。牛血清清蛋白用h2o 或0.9%nacl配制，酪蛋白用0．05n naoh配制。 （2）雙縮脲試劑：稱以1.50克硫酸銅（cuso4•5h2o）和6.0克酒石酸鉀鈉（knac4h4o6•4h2o），用500毫升水溶解，在攪拌下加入300毫升10% naoh溶液，用水稀釋到1升，貯存于塑料瓶中（或內(nèi)壁涂以石蠟的瓶中）。此試劑可長期保存。若貯存瓶中有黑色沉淀出現(xiàn)，則需要重新配制。 2. 器材： 可見光分光光度計、大試管15支、旋渦混合器等。 （三）操作方法 1. 標準曲線的測定：取12支試管分兩組，分別加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的標準蛋白質溶液，用水補足到1毫升，然后加入4毫升雙縮脲試劑。充分搖勻后，在室溫（20～25℃）下放置30分鐘，于540nm處進行比色測定。用未加蛋白質溶液的diyi支試管作為空白對照液。取兩組測定的平均值，以蛋白質的含量為橫座標，光吸收值為縱座標繪制標準曲線。 2、樣品的測定：取2～3個試管，用上述同樣的方法，測定未知樣品的蛋白質濃度。注意樣品濃度不要超過10mg/ml。 三、folin—酚試劑法（lowry法） （一）實驗原理 這種蛋白質測定法是Z靈敏的方法之一。過去此法是應用Z廣泛的一種方法，由于其試劑乙的配制較為困難（現(xiàn)在已可以訂購），近年來逐漸被考馬斯亮蘭法所取代。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即folin—酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測蛋白質的靈敏度。這兩種顯色反應產(chǎn)生深蘭色的原因是：在堿性條件下，蛋白質中的肽鍵與銅結合生成復合物。folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。 folin—酚試劑法Z早由lowry確定了蛋白質濃度測定的基本步驟。以后在生物化學領域得到廣泛的應用。這個測定法的優(yōu)點是靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多，缺點是費時間較長，要精確控制操作時間，標準曲線也不是嚴格的直線形式，且專一性較差，干擾物質較多。對雙縮脲反應發(fā)生干擾的離子，同樣容易干擾lowry反應。而且對后者的影響還要大得多。酚類、檸檬酸、硫酸銨、tris緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。濃度較低的尿素（0.5%），硫酸納（1%），硝酸納（1%），三（0.5%），乙醇（5%），（5%），丙酮（0.5%）等溶液對顯色無影響，但這些物質濃度高時，必須作校正曲線。含硫酸銨的溶液，只須加濃碳酸鈉—氫氧化鈉溶液，即可顯色測定。若樣品酸度較高，顯色后會色淺，則必須提高碳酸鈉—氫氧化鈉溶液的濃度1～2倍。 進行測定時，加folin—酚試劑時要特別小心，因為該試劑僅在酸性ph條件下穩(wěn)定，但上述還原反應只在ph=10的情況下發(fā)生，故當folin一酚試劑加到堿性的銅—蛋白質溶液中時，必須立即混勻，以便在磷鉬酸—磷鎢酸試劑被破壞之前，還原反應即能發(fā)生。 此法也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測定。 此法可檢測的Z低蛋白質量達5mg。通常測定范圍是20~250mg。 （二）試劑與器材 1.試劑 （1）試劑甲： （a）10克 na2co3，2克 naoh和0.25克酒石酸鉀鈉 （knac4h4o6•4h2o）。溶解于500毫升蒸餾水中。 （b）0.5克硫酸銅（cuso4•5h2o）溶解于100毫升蒸餾水中，每次使用前，將50份（a）與1份（b）混合，即為試劑甲。 （2）試劑乙：在2升磨口回流瓶中，加入100克鎢酸鈉（na2wo4•2h2o），25克鉬酸鈉（na2moo4•2h2o）及700毫升蒸餾水，再加50毫升85%磷酸，100毫升濃鹽酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小時，回流結束時，加入150克硫 酸 鋰（li2so4），50毫升蒸餾水及數(shù)滴液體溴，開口繼續(xù)沸騰15分鐘，以便驅除過量的溴。冷卻后溶液呈黃色（如仍呈綠色，須再重復滴加液體溴的步驟）。稀釋至1升，過濾，濾液置于棕色試劑瓶中保存。使用時用標準naoh滴定，酚酞作指示劑，然后適當稀釋，約加水1倍，使Z終的酸濃度為1n左右。 （3）標準蛋白質溶液: 精確稱取結晶牛血清清蛋白或 g—球蛋白，溶于蒸餾水，濃度為250mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混濁，可改用0.9%nacl溶液。 2. 器材 （1）可見光分光光度計 （2）旋渦混合器 （3）秒表 （4）試管16支 （三）操作方法 1. 標準曲線的測定：取16支大試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其余試管分成兩組，分別加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升標準蛋白質溶液（濃度為250mg/ml）。用水補足到1.0毫升，然后每支試管加入5毫升試劑甲，在旋渦混合器上迅速混合，于室溫（20～25℃）放置10分鐘。再逐管加入0.5毫升試劑乙（folin—酚試劑），同樣立即混勻。這一步混合速度要快，否則會使顯色程度減弱。然后在室溫下放置30分鐘，以未加蛋白質溶液的diyi支試管作為空白對照，于700nm處測定各管中溶液的吸光度值。以蛋白質的量為橫座標，吸光度值為縱座標，繪制出標準曲線。 注意：因lowry反應的顯色隨時間不斷加深，因此各項操作必須精確控制時間，即第1支試管加入5毫升試劑甲后，開始計時，1分鐘后，第2支試管加入5毫升試劑甲，2分鐘后加第3支試管，余此類推。全部試管加完試劑甲后若已超過10分鐘，則第1支試管可立即加入0.5毫升試劑乙，1分鐘后第2支試管加入0.5毫升試劑乙，2分鐘后加第3支試管，余此類推。待Z后一支試管加完試劑后，再放置30分鐘，然后開始測定光吸收。每分鐘測一個樣品。 進行多試管操作時，為了防止出錯，每位學生都必須在實驗記錄本上預先畫好下面的表格。表中是每個試管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的順序，逐管加入。Z下面兩排是計算出的每管中蛋白質的量（微克）和測得的吸光度值。 folin—酚試劑法實驗表 管號 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 標準蛋白質 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 （250mg/ml） 未知蛋白質 0.2 0.4 0.6 （約250mg/ml） 蒸餾水 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.6 0.4 試劑甲 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 試劑乙 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 每管中蛋白質的量（mg） 吸光度值（a700） 2. 樣品的測定：取1毫升樣品溶液（其中約含蛋白質20~250微克），按上述方法進行操作，取1毫升蒸餾水代替樣品作為空白對照。通常樣品的測定也可與標準曲線的測定放在一起，同時進行。即在標準曲線測定的各試管后面，再增加3個試管。如上表中的8、9、10試管。 根據(jù)所測樣品的吸光度值，在標準曲線上查出相應的蛋白質量，從而計算出樣品溶液的蛋白質濃度。 注意:由于各種蛋白質含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，顯色的深淺往往隨不同的蛋白質而變化。因而本測定法通常只適用于測定蛋白質的相對濃度（相對于標準蛋白質）。 四、改良的簡易folin—酚試劑法 （一）試劑 1. 試劑甲：堿性銅試劑溶液中，含0.5n naoh、10%na2co3、0.1%酒石酸鉀和0.05%硫酸銅，配制時注意硫酸銅用少量蒸餾水溶解后，Z后加入。2. 試劑乙：與前面的基本法相同。臨用時加蒸餾水稀釋8倍。 3. 標準蛋白質溶液：同基本法。 （二）操作步驟 測定標準曲線與樣品溶液的操作方法與基本法相同。只是試劑甲改為1毫升，室溫放置10分鐘后，試劑乙改為4毫升。在55℃恒溫水浴中保溫5分鐘。用流動水冷卻后，在660nm下測定其吸光度值。 改良的快速簡易法，可獲得與 folin—酚試劑法（即lowry基本法）相接近的結果。 五、考馬斯亮蘭法（bradford法） （一）實驗原理 雙縮脲法（biuret法）和folin—酚試劑法（lowry法）的明顯缺點和許多限制，促使科學家們?nèi)ふ腋玫牡鞍踪|溶液測定的方法。 1976年由bradford建立的考馬斯亮蘭法（bradford法），是根據(jù)蛋白質與染料相結合的原理設計的。這種蛋白質測定法具有超過其他幾種方法的突出優(yōu)點，因而正在得到廣泛的應用。這一方法是目前靈敏度Z高的蛋白質測定法。 考馬斯亮蘭g-250染料，在酸性溶液中與蛋白質結合，使染料的Z大吸收峰的位置（lmax），由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。經(jīng)研究認為，染料主要是與蛋白質中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結合。 在595nm下測定的吸光度值a595，與蛋白質濃度成正比。 bradford法的突出優(yōu)點是： （1）靈敏度高，據(jù)估計比lowry法約高四倍，其Z低蛋白質檢測量可達1mg。這是因為蛋白質與染料結合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質－染料復合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質濃度的變化比lowry法要大的多。 （2）測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個樣品的測定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質結合的過程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性Z好。因而完全不用像lowry法那樣費時和嚴格地控制時間。 （3）干擾物質少。如干擾lowry法的k+、na+、mg2+離子、tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、edta等均不干擾此測定法。 此法的缺點是： （1）由于各種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此bradford法用于不同蛋白質測定時有較大的偏差，在制作標準曲線時通常選用 g—球蛋白為標準蛋白質，以減少這方面的偏差。 （2）仍有一些物質干擾此法的測定，主要的干擾物質有：去污劑、 triton x-100、十二烷基硫酸鈉（sds）和0.1n的naoh。（如同0.1n的酸干擾lowary法一樣）。 （3）標準曲線也有輕微的非線性，因而不能用beer定律進行計算，而只能用標準曲線來測定未知蛋白質的濃度。 （二）試劑與器材 1. 試劑： （1）標準蛋白質溶液，用 g—球蛋白或牛血清清蛋白(bsa)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的標準蛋白質溶液。 （2）考馬斯亮蘭g—250染料試劑：稱100mg考馬斯亮蘭g—250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀釋至1升。 2. 器材： （1）可見光分光光度計 （2）旋渦混合器 （3）試管16支 （三）操作方法 1. 標準方法 （1）取16支試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其余試管分為兩組按表中順序，分別加入樣品、水和試劑，即用1.0mg/ml的標準蛋白質溶液給各試管分別加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用無離子水補充到0.1ml。Z后各試管中分別加入5.0ml考馬斯亮蘭g—250試劑，每加完一管，立即在旋渦混合器上混合（注意不要太劇烈，以免產(chǎn)生大量氣泡而難于消除）。未知樣品的加樣量見下表中的第8、9、10管。 （2）加完試劑2-5分鐘后，即可開始用比色皿，在分光光度計上測定各樣品在595nm處的光吸收值a595，空白對照為第1號試管，即0.1mlh2o加5.0mlg—250試劑。 注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇蕩洗，以洗去染色。塑料比色皿決不可用乙醇或丙酮長時間浸泡。 考馬斯亮蘭法實驗表 管 號 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 標準蛋白質 0 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 (1.0mg/ml) 未知蛋白質 0.02 0.04 0.06 (約1.0mg/ml) 蒸餾水 0.1 0.09 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0.08 0.06 0.04 考馬斯亮藍 g－250試劑 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 每管中的蛋 白質量（mg） 光吸收值 （a595） （3）用標準蛋白質量（mg）為橫座標，用吸光度值a595為縱座標，作圖，即得到一條標準曲線。由此標準曲線，根據(jù)測出的未知樣品的a595值，即可查出未知樣品的蛋白質含量。 0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的a595約為0.50。 2. 微量法 當樣品中蛋白質濃度較稀時（10－100mg/ml），可將取樣量（包括補加的水）加大到0.5ml或1.0ml， 空白對照則分別為0.5ml或1.0ml h2o， 考馬斯亮藍g－250試劑仍加5.0ml， 同時作相應的標準曲線，測定595nm的光吸收值。 0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的a595約為0.29。 六、紫外吸收法 蛋白質分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質具有吸收紫外光的性質。吸收高峰在280nm處，其吸光度（即光密度值）與蛋白質含量成正比。此外，蛋白質溶液在238nm的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用一定波長下，蛋白質溶液的光吸收值與蛋白質濃度的正比關系，可以進行蛋白質含量的測定。 紫外吸收法簡便、靈敏、快速，不消耗樣品，測定后仍能回收使用。低濃度的鹽，例如生化制備中常用的（nh4）2so4等和大多數(shù)緩沖液不干擾測定。特別適用于柱層析洗脫液的快速連續(xù)檢測，因為此時只需測定蛋白質濃度的變化，而不需知道其值。 此法的特點是測定蛋白質含量的準確度較差，干擾物質多，在用標準曲線法測定蛋白質含量時，對那些與標準蛋白質中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質，有一定的誤差。故該法適于用測定與標準蛋白質氨基酸組成相似的蛋白質。若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質，會出現(xiàn)較大的干擾。核酸的干擾可以通過查校正表，再進行計算的方法，加以適當?shù)男Ｕ?。但是因為不同的蛋白質和核酸的紫外吸收是不相同的，雖然經(jīng)過校正，測定的結果還是存在一定的誤差。 此外，進行紫外吸收法測定時，由于蛋白質吸收高峰常因ph的改變而有變化，因此要注意溶液的ph值，測定樣品時的ph要與測定標準曲線的ph相一致。 下面介紹四種紫外吸收法： 1. 280nm的光吸收法 因蛋白質分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm處具有Z大吸收，且各種蛋白質的這三種氨基酸的含量差別不大，因此測定蛋白質溶液在280nm處的吸光度值是Z常用的紫外吸收法。 測定時，將待測蛋白質溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白質溶液的溶劑（水或緩沖液）作空白對照，在紫外分光度計上直接讀取280nm的吸光度值a280。蛋白質濃度可控制在0.1～1.0mg/ml左右。通常用1cm光徑的標準石英比色皿，盛有濃度為1mg/ml的蛋白質溶液時，a280約為1.0左右。由此可立即計算出蛋白質的大致濃度。 許多蛋白質在一定濃度和一定波長下的光吸收值（a1％1cm）有文獻數(shù)據(jù)可查，根據(jù)此光吸收值可以較準確地計算蛋白質濃度。下式列出了蛋白質濃度與（a1％1cm）值（即蛋白質溶液濃度為1%，光徑為1cm時的光吸收值）的關系。文獻值a1％1cm，?稱為百分吸收系數(shù)或比吸收系數(shù)。 蛋白質濃度 = (a280′10 )/ a1％1cm，280nm (mg/ml) (q 1%濃度?10mg/ml) 例：牛血清清蛋白 ： a1％1cm=6.3 (280nm) 溶菌酶 ： a1％1cm=22.8 (280nm) 若查不到待測蛋白質的a1％1cm值，則可選用一種與待測蛋白質的酪氨酸和色氨酸含量相近的蛋白質作為標準蛋白質，用標準曲線法進行測定。標準蛋白質溶液配制的濃度為1.0mg/ml。常用的標準蛋白質為牛血清清蛋白（bsa）。 標準曲線的測定：取6支試管，按下表編號并加入試劑： 管號 1 2 3 4 5 6 bsa（1.0mg/ml） 0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 h2o 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0 a280 用第1管為空白對照，各管溶液混勻后在紫外分光光度計上測定吸光度a280，以a280為縱座標，各管的蛋白質濃度或蛋白質量（mg）為橫座標作圖，標準曲線應為直線，利用此標準曲線，根據(jù)測出的未知樣品的a280值，即可查出未知樣品的蛋白質含量，也可以用2至6管a280值與相應的試管中的蛋白質濃度計算出該蛋白質的a1％1cm，280nm 2. 280nm和260nm的吸收差法 核酸對紫外光有很強的吸收，在280nm處的吸收比蛋白質強10倍（每克），但核酸在260nm處的吸收更強，其吸收高峰在260nm附近。核酸260nm處的消光系數(shù)是280nm處的2倍，而蛋白質則相反，280nm紫外吸收值大于260nm的吸收值。通常： 純蛋白質的光吸收比值：a280/a260 ? 1.8 純核酸的光吸收比值： a280/a260 ? 0.5 含有核酸的蛋白質溶液，可分別測定其a280和a260，由此吸收差值，用下面的經(jīng)驗公式，即可算出蛋白質的濃度。 蛋白質濃度(mg/ml)=1.45×a280－0.74×a260 此經(jīng)驗公式是通過一系列已知不同濃度比例的蛋白質（酵母烯醇化酶）和核酸（酵母核酸）的混合液所測定的數(shù)據(jù)來建立的。 3. 215nm與225nm的吸收差法 蛋白質的稀溶液由于含量低而不能使用280nm的光吸收測定時，可用215nm與225nm吸收值之差，通過標準曲線法來測定蛋白質稀溶液的濃度。 用已知濃度的標準蛋白質，配制成20～100 mg/ml的一系列5.0ml的蛋白質溶液，分別測定215nm和225nm的吸光度值，并計算出吸收差： 吸收差d= a215 －a225 以吸收差d為縱座標，蛋白質濃度為橫座標，繪出標準曲線。再測出未知樣品的吸收差，即可由標準曲線上查出未知樣品的蛋白質濃度。 本方法在蛋白質濃度20~100mg/ml范圍內(nèi)，蛋白質濃度與吸光度成正比，nacl、（nh4）2so4以及0.1m磷酸、硼酸和tris等緩沖液，都無顯著干擾作用，但是0.1n naoh， 0.1m乙酸、琥珀酸、鄰苯二甲酸、等緩沖液的215nm光吸收值較大，必須將其濃度降到0.005m以下才無顯著影響。 4. 肽鍵測定法 蛋白質溶液在238nm處的光吸收的強弱，與肽鍵的多少成正比。因此可以用標準蛋白質溶液配制一系列50～500mg/ml已知濃度的5.0ml蛋白質溶液，測定238nm的光吸收值a238，以a238為縱座標， 蛋白質含量為橫座標，繪制出標準曲線。未知樣品的濃度即可由標準曲線求得。 進行蛋白質溶液的柱層析分離時，洗脫液也可以用238nm檢測蛋白質的峰位。 本方法比280nm吸收法靈敏。但多種有機物，如醇、酮、醛、醚、有機酸、酰胺類和過氧化物等都有干擾作用。所以Z好用無機鹽，無機堿和水溶液進行測定。若含有有機溶劑，可先將樣品蒸干，或用其他方法除去干擾物質，然后用水、稀酸和稀堿溶解后再作測定。

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