培養(yǎng)細胞需注意哪些小細節(jié)?

　　培養(yǎng)細胞就像養(yǎng)育孩子一樣，要精心照料，用心呵護。每天都去看看它們，滿足它們所需要的物質需求，防止出現培養(yǎng)箱缺水、二氧化碳不足、溫度不夠等各種小意外，還要注意很多小細節(jié)，以免開展重復的實驗導致不必要的人力物力浪費。

　　那培養(yǎng)細胞都要注意哪些小細節(jié)呢?就讓我們一起來看看吧!

　　1.細胞生長的營養(yǎng)來源

　　不同的細胞的培養(yǎng)基是不相同的，對于大多數腫瘤細胞來說，營養(yǎng)配方一般為：90%合成培養(yǎng)基(DMEM、RPMI1640、MEM等)和10%胎牛血清(FBS);為了防止污染，可以適時加1%雙抗，抗生素的使用應為短期。

　　Q：細胞培養(yǎng)基配方如何選擇?

　　A: 一般購買細胞時，針對不同的細胞株，會有詳細的介紹，包括生長的狀態(tài)圖、培養(yǎng)基的類型等。如人源肺癌細胞A549可用DMEM培養(yǎng)基，在胎牛血清的選擇上也可以選用來源可靠的胎牛血清，能提供較好的營養(yǎng)成分，以滿足細胞株生長的需要。

　　Q：如果細胞生長緩慢，需要增加血清比例嗎?

　　A：可以。

　　2.細胞生長的環(huán)境

　　舒適無菌的環(huán)境是細胞健康生活的重要基礎。需要合適的器皿，不同形狀、規(guī)格、用途多樣的培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)板等，最終進入合適的恒溫箱培養(yǎng)，如腫瘤細胞就需37℃，5%CO2的恒溫箱中生長。

　　Q：細胞培養(yǎng)板及培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶如何選擇?

　　A：根據不同的應用選擇不同的培養(yǎng)皿或容量板，如MTS用96孔板，細胞爬片用24孔，流式分析用6空等

　　而選擇培養(yǎng)皿還是選擇培養(yǎng)瓶，就細胞培養(yǎng)狀態(tài)來說差別不大，主要是培養(yǎng)瓶的安全系數更高一些，數量也會大一些，但是成本也相對較高，因此沒有特殊要求時，一般用培養(yǎng)皿即可。

　　Q：血清是否要滅活處理，保證環(huán)境無菌?

　　A：這取決于您的應用。

　　滅活過程中，會導致血清中某些成分被破壞，如氨基酸，維生素，生長因子等。所以只有在您的實驗對血清有特殊要求時，才會考慮對血清進行滅活處理。如您的實驗對血清中的某種組分敏感，需要去除該組分。最常見的情況是需要去除血清中的補體蛋白，因為補體在機體中參與細胞殺傷，巨噬細胞和淋巴細胞活化，肥大細胞和血小板組胺釋放，平滑肌收縮等過程，所以一般在免疫學相關研究中及肌細胞和干細胞的培養(yǎng)過程中需要對血清進行滅活處理。

　　3.細胞復蘇與凍存

　　細胞復蘇是指將凍存的細胞解凍之后再重新培養(yǎng)，細胞從冷凍停止生長狀態(tài)恢復生長的過程。

　　Q：細胞復蘇后，為什么很多難以貼壁?

　　A：忽略培養(yǎng)基的問題，主要考慮細胞凍存時狀態(tài)差或者復蘇時動作太慢導致細胞死亡。切記最重要的融化速度要快，可不時搖動冷凍管，使之盡快通過最易受損的溫度段(-5～0℃)。

　　細胞凍存則是將細胞放在低溫(-70℃~196℃)環(huán)境，降低細胞內的代謝活動，最/大限度的保存細胞活力，以便長期存儲。

　　Q：目前細胞凍存液多采用的什么配方?

　　A：目前細胞凍存多采用DMSO二甲基亞砜或甘油作保護劑，細胞凍存液的配方有很多種，如培養(yǎng)基：血清：DMSO=7:2:1或8：1：1或5：4：1，或直接用血清：DMSO=9:1，一般高濃度血清有助于維護細胞活力，復蘇存活率在80%～90%以上。

　　4.細胞的傳代培養(yǎng)

　　細胞在培養(yǎng)過程中不斷增殖，培養(yǎng)皿空間有限，細胞過密生長就會受到抑制，影響細胞的狀態(tài)，因此我們要把細胞中的一部分分到別的培養(yǎng)皿里，這樣細胞才能生長的好。

　　Q：細胞傳代培養(yǎng)為什么要選擇對數期細胞?

　　A: 細胞的生長和分裂，一般遵循以下模式：停滯期，對數期(指數期)，平穩(wěn)期(平臺期)和衰退期。為了確?；盍?，遺傳穩(wěn)定性和表型穩(wěn)定，必須使細胞保持在對數期。一般細胞長到70%~80%左右就可以傳代了。

　　除了上述幾個環(huán)節(jié)的關節(jié)問題外，細胞培養(yǎng)還有很多小問題如下：

　　Q：培養(yǎng)基多久換一次?

　　A: 正常情況下，培養(yǎng)液偏紅色。如果細胞維持在pH6.5～6.6條件下，培養(yǎng)基變黃，說明培養(yǎng)液中代謝產物已堆積到一定量，細胞會脫落死亡，需要更換新鮮培養(yǎng)液。一般細胞生長旺盛時1～2天換一次，生長緩慢時，3～4天亦可。針對復蘇后的細胞，建議隔天換液。

　　Q：血清應如何融解?

　　A：從冰箱中取出血清，放于2-8℃融化，融化過程中不時旋轉(swirling mix)混勻。充分融解后分裝或平衡到室溫后使用。

　　Q：如果細胞形態(tài)不清晰或有異物等，如何處理?

　　A：可以考慮如下操作：首先，倒掉舊的培養(yǎng)基，用新的培養(yǎng)基或者PBS洗滌2-3次，再開始正式的消化、吹打。其次，把吹打下來的細胞懸液加入到新的培養(yǎng)瓶內。后續(xù)再密切觀察。

　　Q：血清中出現絮狀沉淀是否需要去除?如何去除?

　　A：多種原因可能導致絮狀沉淀的形成，最常見的原因之一是融化過程中，脂蛋白聚集所致。該現象一般不會影響產品質量?？梢?00g離心5分鐘，取上清，然后過濾。根據需要選擇合適的濾膜孔徑，一般最常用的是0.22um PES材質的濾膜。為避免濾膜阻塞，建議離心后取上清加入培養(yǎng)基內一起過濾而不是直接過濾血清。

　　總之，細胞培養(yǎng)是后續(xù)實驗的基石，留心各種細節(jié)問題，嚴守滅菌處理的程序，保護好自己養(yǎng)的細胞，這樣才能快樂地進行后續(xù)的實驗。

　　培養(yǎng)細胞需注意哪些小細節(jié)?本生一直視質量控制為企業(yè)的生命，追求企業(yè)競爭力的不斷提升。公司在經營中始終秉承：遵紀守法，嚴于律己，寬仁以待，敢于承擔的企業(yè)精神作為標準，以過硬的質量和優(yōu)良的服務來維護和拓展市場，較大限度的滿足客戶的需求。與客戶的共贏，是我們的發(fā)展目標。本生!您信任的合作伙伴。我們愿與您真誠合作，共創(chuàng)美好的未來。

　　做ELISA實驗需要注意哪些問題?

　　Elisa實驗中應該注意的問題,包括樣品稀釋、試劑盒平衡、樣品和試劑的混勻、加樣、溫育等問題.Elisa試劑盒有著準確性高、靈敏度高、特異性強的諸多優(yōu)點,深受廣大用戶朋友的喜愛.然而,在實驗過程中,也需要注意很多問題.對此,上海哈靈生物提醒你您,需要遵守一些規(guī)則,才能更好地進行實驗,取得較好的實驗成果.

　　Elisa方法被廣泛應用于各種抗原和抗體測定.在Elisa測定中影響因素較多,在檢測過程中除正常反應外,有時常見到一些錯誤的結果.引起ELISA測定錯誤結果的原因主要有：標本因素;試劑因素;操作因素.

　　1.樣品稀釋

　　一般產品的樣品稀釋倍數均通過大量試驗確定,以保證試驗的靈敏度和特異性.酶聯免疫反應是一種敏感性很高的反應,如果血清不稀釋,不可避免會產生很強的非特異性反應,出現假陽性.

　　2.試劑盒平衡

　　Elisa中所有試劑和板條均應在試驗前平衡至室溫(約25℃),一般需在室溫放置20～30分鐘以上.平衡時間太短會造成試劑混勻不夠,樣品孵育時間相對縮短,ELISA反應不夠充分.冬季室溫低,可將試劑盒置37℃溫箱20分鐘.

　　3.樣品和試劑的混勻

　　在稀釋前、后的樣品必須充分混勻,所有試劑在加樣前也須搖勻,以保證試驗的均一性.

　　4.加樣

　　加樣是一項很重要的步驟.加樣不可太快,要避免加在孔壁上部,不可濺出和產生氣泡.加樣太快,無法保證微量加樣的準確性和均一性.加在孔壁上部的非包被區(qū),易導致非特異吸附.

　　5.溫育

　　溫育是ELISA測定中影響測定成敗為關鍵的一個因素.ELISA作為一種固相免疫測定,抗原抗體的結合反應在固相上進行,要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異抗體或抗原完全結合,必須在一定的溫度條件下反應一定的時間.

　　6.洗板

　　固相免疫測定技術是一種非均相免疫測定技術,需以洗滌操作將特異結合于固相的抗原或抗體與反應溫育過程中吸附的非特異成份分離開來,以保證ELISA測定的特異性.洗液盡量不要溢出孔外;加洗液后要靜置1分鐘,甩去板孔中洗液后,一定要大力拍干;及時更換吸水紙,尤其是拍過酶標記物的吸水紙一定要棄去,否則可能影響試驗結果.

　　7.顯色

　　顯色一定要控制時間,根據試劑盒說明操作即可.一般來說,顯色時間過短,結果偏低;顯色時間過長,空白增高或者非特異性顯色增加.

　　8.比色

　　比色要注意波長的選擇.以TMB為底物和以OPD為底物的試劑盒均有使用,而前者比色波長為450nm,后者為492nm,濾光片需根據要求隨時更換.因此,容易出現濾光片錯用的問題.

　　做ELISA實驗需要注意哪些問題? 我司由具有行業(yè)背景和豐富市場經驗的業(yè)人士組成，于為生命科學研究域提供產品，為廣大科研工作者提供服務。 既能滿足研發(fā)類客戶對產品種類、包裝的特殊要求，也能滿足生產型企業(yè)從小試、中試到規(guī)?；a各個階段的綜合需求。本生!您信任的合作伙伴。我們愿與您真誠合作，共創(chuàng)美好的未來。