培養(yǎng)細(xì)胞需注意哪些小細(xì)節(jié)?

　　培養(yǎng)細(xì)胞就像養(yǎng)育孩子一樣，要精心照料，用心呵護。每天都去看看它們，滿足它們所需要的物質(zhì)需求，防止出現(xiàn)培養(yǎng)箱缺水、二氧化碳不足、溫度不夠等各種小意外，還要注意很多小細(xì)節(jié)，以免開展重復(fù)的實驗導(dǎo)致不必要的人力物力浪費。

　　那培養(yǎng)細(xì)胞都要注意哪些小細(xì)節(jié)呢?就讓我們一起來看看吧!

　　1.細(xì)胞生長的營養(yǎng)來源

　　不同的細(xì)胞的培養(yǎng)基是不相同的，對于大多數(shù)腫瘤細(xì)胞來說，營養(yǎng)配方一般為：90%合成培養(yǎng)基(DMEM、RPMI1640、MEM等)和10%胎牛血清(FBS);為了防止污染，可以適時加1%雙抗，抗生素的使用應(yīng)為短期。

　　Q：細(xì)胞培養(yǎng)基配方如何選擇?

　　A: 一般購買細(xì)胞時，針對不同的細(xì)胞株，會有詳細(xì)的介紹，包括生長的狀態(tài)圖、培養(yǎng)基的類型等。如人源肺癌細(xì)胞A549可用DMEM培養(yǎng)基，在胎牛血清的選擇上也可以選用來源可靠的胎牛血清，能提供較好的營養(yǎng)成分，以滿足細(xì)胞株生長的需要。

　　Q：如果細(xì)胞生長緩慢，需要增加血清比例嗎?

　　A：可以。

　　2.細(xì)胞生長的環(huán)境

　　舒適無菌的環(huán)境是細(xì)胞健康生活的重要基礎(chǔ)。需要合適的器皿，不同形狀、規(guī)格、用途多樣的培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)板等，最終進入合適的恒溫箱培養(yǎng)，如腫瘤細(xì)胞就需37℃，5%CO2的恒溫箱中生長。

　　Q：細(xì)胞培養(yǎng)板及培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶如何選擇?

　　A：根據(jù)不同的應(yīng)用選擇不同的培養(yǎng)皿或容量板，如MTS用96孔板，細(xì)胞爬片用24孔，流式分析用6空等

　　而選擇培養(yǎng)皿還是選擇培養(yǎng)瓶，就細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)來說差別不大，主要是培養(yǎng)瓶的安全系數(shù)更高一些，數(shù)量也會大一些，但是成本也相對較高，因此沒有特殊要求時，一般用培養(yǎng)皿即可。

　　Q：血清是否要滅活處理，保證環(huán)境無菌?

　　A：這取決于您的應(yīng)用。

　　滅活過程中，會導(dǎo)致血清中某些成分被破壞，如氨基酸，維生素，生長因子等。所以只有在您的實驗對血清有特殊要求時，才會考慮對血清進行滅活處理。如您的實驗對血清中的某種組分敏感，需要去除該組分。最常見的情況是需要去除血清中的補體蛋白，因為補體在機體中參與細(xì)胞殺傷，巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞活化，肥大細(xì)胞和血小板組胺釋放，平滑肌收縮等過程，所以一般在免疫學(xué)相關(guān)研究中及肌細(xì)胞和干細(xì)胞的培養(yǎng)過程中需要對血清進行滅活處理。

　　3.細(xì)胞復(fù)蘇與凍存

　　細(xì)胞復(fù)蘇是指將凍存的細(xì)胞解凍之后再重新培養(yǎng)，細(xì)胞從冷凍停止生長狀態(tài)恢復(fù)生長的過程。

　　Q：細(xì)胞復(fù)蘇后，為什么很多難以貼壁?

　　A：忽略培養(yǎng)基的問題，主要考慮細(xì)胞凍存時狀態(tài)差或者復(fù)蘇時動作太慢導(dǎo)致細(xì)胞死亡。切記最重要的融化速度要快，可不時搖動冷凍管，使之盡快通過最易受損的溫度段(-5～0℃)。

　　細(xì)胞凍存則是將細(xì)胞放在低溫(-70℃~196℃)環(huán)境，降低細(xì)胞內(nèi)的代謝活動，最/大限度的保存細(xì)胞活力，以便長期存儲。

　　Q：目前細(xì)胞凍存液多采用的什么配方?

　　A：目前細(xì)胞凍存多采用DMSO二甲基亞砜或甘油作保護劑，細(xì)胞凍存液的配方有很多種，如培養(yǎng)基：血清：DMSO=7:2:1或8：1：1或5：4：1，或直接用血清：DMSO=9:1，一般高濃度血清有助于維護細(xì)胞活力，復(fù)蘇存活率在80%～90%以上。

　　4.細(xì)胞的傳代培養(yǎng)

　　細(xì)胞在培養(yǎng)過程中不斷增殖，培養(yǎng)皿空間有限，細(xì)胞過密生長就會受到抑制，影響細(xì)胞的狀態(tài)，因此我們要把細(xì)胞中的一部分分到別的培養(yǎng)皿里，這樣細(xì)胞才能生長的好。

　　Q：細(xì)胞傳代培養(yǎng)為什么要選擇對數(shù)期細(xì)胞?

　　A: 細(xì)胞的生長和分裂，一般遵循以下模式：停滯期，對數(shù)期(指數(shù)期)，平穩(wěn)期(平臺期)和衰退期。為了確保活力，遺傳穩(wěn)定性和表型穩(wěn)定，必須使細(xì)胞保持在對數(shù)期。一般細(xì)胞長到70%~80%左右就可以傳代了。

　　除了上述幾個環(huán)節(jié)的關(guān)節(jié)問題外，細(xì)胞培養(yǎng)還有很多小問題如下：

　　Q：培養(yǎng)基多久換一次?

　　A: 正常情況下，培養(yǎng)液偏紅色。如果細(xì)胞維持在pH6.5～6.6條件下，培養(yǎng)基變黃，說明培養(yǎng)液中代謝產(chǎn)物已堆積到一定量，細(xì)胞會脫落死亡，需要更換新鮮培養(yǎng)液。一般細(xì)胞生長旺盛時1～2天換一次，生長緩慢時，3～4天亦可。針對復(fù)蘇后的細(xì)胞，建議隔天換液。

　　Q：血清應(yīng)如何融解?

　　A：從冰箱中取出血清，放于2-8℃融化，融化過程中不時旋轉(zhuǎn)(swirling mix)混勻。充分融解后分裝或平衡到室溫后使用。

　　Q：如果細(xì)胞形態(tài)不清晰或有異物等，如何處理?

　　A：可以考慮如下操作：首先，倒掉舊的培養(yǎng)基，用新的培養(yǎng)基或者PBS洗滌2-3次，再開始正式的消化、吹打。其次，把吹打下來的細(xì)胞懸液加入到新的培養(yǎng)瓶內(nèi)。后續(xù)再密切觀察。

　　Q：血清中出現(xiàn)絮狀沉淀是否需要去除?如何去除?

　　A：多種原因可能導(dǎo)致絮狀沉淀的形成，最常見的原因之一是融化過程中，脂蛋白聚集所致。該現(xiàn)象一般不會影響產(chǎn)品質(zhì)量?？梢?00g離心5分鐘，取上清，然后過濾。根據(jù)需要選擇合適的濾膜孔徑，一般最常用的是0.22um PES材質(zhì)的濾膜。為避免濾膜阻塞，建議離心后取上清加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾而不是直接過濾血清。

　　總之，細(xì)胞培養(yǎng)是后續(xù)實驗的基石，留心各種細(xì)節(jié)問題，嚴(yán)守滅菌處理的程序，保護好自己養(yǎng)的細(xì)胞，這樣才能快樂地進行后續(xù)的實驗。

　　培養(yǎng)細(xì)胞需注意哪些小細(xì)節(jié)?本生一直視質(zhì)量控制為企業(yè)的生命，追求企業(yè)競爭力的不斷提升。公司在經(jīng)營中始終秉承：遵紀(jì)守法，嚴(yán)于律己，寬仁以待，敢于承擔(dān)的企業(yè)精神作為標(biāo)準(zhǔn)，以過硬的質(zhì)量和優(yōu)良的服務(wù)來維護和拓展市場，較大限度的滿足客戶的需求。與客戶的共贏，是我們的發(fā)展目標(biāo)。本生!您信任的合作伙伴。我們愿與您真誠合作，共創(chuàng)美好的未來。

氮氣發(fā)生器以空氣作為原料，以碳分子篩作為吸附劑，運用變壓吸附原理，利用碳分子篩對氧和氮的選擇性吸附而使氮和氧分離的方法，與傳統(tǒng)制氮法相比，它具有工藝流程簡單、自動化程度高、產(chǎn)氣快(16-30分鐘)、能耗低，產(chǎn)品純度可在較大范圍內(nèi)根據(jù)用戶需要進行調(diào)節(jié)，操作維護方便、運行成本較低、裝置適應(yīng)性較強等特點，故在1000Nm3/h以下的儀器中頗具競爭力，越來越得到中、小型氮氣用戶的歡迎，該儀器已成為中、小型氮氣用戶的理想選擇設(shè)備。
儀器是通過空氣壓縮機將外界的空氣收集到儲氣罐中，再將空氣通入電解分離池，氮氣和氧氣在電解池內(nèi)產(chǎn)生分離。氧氣被釋放到大氣中，氮氣經(jīng)過凈化、干燥后輸出，通過系統(tǒng)壓力可以自動調(diào)節(jié)氮氣輸出量。儀器可間斷使用，也可連續(xù)使用，且產(chǎn)氣純度不衰減。設(shè)有多級保護裝置，安全、可靠、穩(wěn)定。本儀器主要由電解系統(tǒng)、壓力控制系統(tǒng)和凈化系統(tǒng)組成。電解氫是采用膜分離技術(shù)，由紅外光電裝置控制壓力，可使氮氣的產(chǎn)量按需量自動調(diào)整，維持壓力穩(wěn)定。
為了確保氣體純度，氮氣發(fā)生器每工作1000小時，需要更換活性炭一次(活性碳為20-40目，鉛筆芯式)；工作過程中壓縮機不啟動，熱保護繼電器啟動，說明壓縮機溫度過高，待冷卻后即可自動恢復(fù)正常。
進氣口過濾器需定期清洗，周期視室內(nèi)粉塵情況而定，可用超聲波清洗，以保持進氣通暢，否則易引起壓縮機工作負(fù)載增大并發(fā)熱，溫度過高時會發(fā)生過熱保護而導(dǎo)致停機；
因壓縮機是感性負(fù)載，通斷電時的瞬時電流比正常工作時高數(shù)倍，較易熔斷保險，應(yīng)選用6A保險管。
由于該儀器配備的壓縮機為開路工作方式，故潤滑油會隨水排出機外，造成消耗，所以在使用一年后適當(dāng)給壓縮機加潤滑油，加油口在壓縮機出氣口旁邊或從進氣口亦可，建議加18號冷凍機油200克。
為避免機內(nèi)存水過多，影響空氣純度，所以每次關(guān)機前需按下排水開關(guān)數(shù)秒鐘即可?？蓪⑴潘诮尤胨芰掀恐斜苊馑鉃R，每日排水不得少于一次。
干燥管應(yīng)定期更換，當(dāng)干燥管中的變色硅膠50%發(fā)生變色時，應(yīng)更換內(nèi)部填料。更換方法：關(guān)閉電源，并排空系統(tǒng)氣體。將凈化管按箭頭所指方向旋下，在旋下凈化管的端蓋，更換硅膠干燥劑。
更換干燥劑時應(yīng)該注意將脫脂棉全部放進管子里，保證對密封端面無任何影響，從而確保端蓋旋緊后能夠密封。
儀器工作不消耗KOH，但建議每半年更換電解液，更換電解液時，先抽出氮氣發(fā)生器中的廢堿液，加入蒸餾水，開動儀器，讓系統(tǒng)清洗電解系統(tǒng)約6-10分鐘，抽出蒸餾水加入配置好的新電解堿液。
要嚴(yán)格執(zhí)行開關(guān)機操作流程，在次使用發(fā)生器時，或者在更換干燥劑之后，將氮氣排空閥置于排空狀態(tài)2小時，確保干燥管內(nèi)空氣全部置換之后，再將手柄拔出。
每次關(guān)閉發(fā)生器電源后，請先打開發(fā)生器背后的儲氣罐排水閥，將空氣儲氣罐中的空氣排盡，空氣和氮氣壓力表降為0即可，然后關(guān)閉儲氣罐排水閥，將氮氣排空閥手柄向內(nèi)推，關(guān)機程序即完成。按此程序關(guān)機后，下一次開機排空時間可縮短至30分鐘，氮氣即可使用。

氮氣發(fā)生器以空氣作為原料，以碳分子篩作為吸附劑，運用變壓吸附原理，利用碳分子篩對氧和氮的選擇性吸附而使氮和氧分離的方法，與傳統(tǒng)制氮法相比，它具有工藝流程簡單、自動化程度高、產(chǎn)氣快(16-30分鐘)、能耗低，產(chǎn)品純度可在較大范圍內(nèi)根據(jù)用戶需要進行調(diào)節(jié)，操作維護方便、運行成本較低、裝置適應(yīng)性較強等特點，故在1000Nm3/h以下的儀器中頗具競爭力，越來越得到中、小型氮氣用戶的歡迎，該儀器已成為中、小型氮氣用戶的理想選擇設(shè)備。
儀器是通過空氣壓縮機將外界的空氣收集到儲氣罐中，再將空氣通入電解分離池，氮氣和氧氣在電解池內(nèi)產(chǎn)生分離。氧氣被釋放到大氣中，氮氣經(jīng)過凈化、干燥后輸出，通過系統(tǒng)壓力可以自動調(diào)節(jié)氮氣輸出量。儀器可間斷使用，也可連續(xù)使用，且產(chǎn)氣純度不衰減。設(shè)有多級保護裝置，安全、可靠、穩(wěn)定。本儀器主要由電解系統(tǒng)、壓力控制系統(tǒng)和凈化系統(tǒng)組成。電解氫是采用膜分離技術(shù)，由紅外光電裝置控制壓力，可使氮氣的產(chǎn)量按需量自動調(diào)整，維持壓力穩(wěn)定。
為了確保氣體純度，氮氣發(fā)生器每工作1000小時，需要更換活性炭一次(活性碳為20-40目，鉛筆芯式)；工作過程中壓縮機不啟動，熱保護繼電器啟動，說明壓縮機溫度過高，待冷卻后即可自動恢復(fù)正常。
進氣口過濾器需定期清洗，周期視室內(nèi)粉塵情況而定，可用超聲波清洗，以保持進氣通暢，否則易引起壓縮機工作負(fù)載增大并發(fā)熱，溫度過高時會發(fā)生過熱保護而導(dǎo)致停機；
因壓縮機是感性負(fù)載，通斷電時的瞬時電流比正常工作時高數(shù)倍，較易熔斷，應(yīng)選用6A管。
由于該儀器配備的壓縮機為開路工作方式，故潤滑油會隨水排出機外，造成消耗，所以在使用一年后適當(dāng)給壓縮機加潤滑油，加油口在壓縮機出氣口旁邊或從進氣口亦可，建議加18號冷凍機油200克。
為避免機內(nèi)存水過多，影響空氣純度，所以每次關(guān)機前需按下排水開關(guān)數(shù)秒鐘即可?？蓪⑴潘诮尤胨芰掀恐斜苊馑鉃R，每日排水不得少于一次。
干燥管應(yīng)定期更換，當(dāng)干燥管中的變色硅膠50%發(fā)生變色時，應(yīng)更換內(nèi)部填料。更換方法：關(guān)閉電源，并排空系統(tǒng)氣體。將凈化管按箭頭所指方向旋下，在旋下凈化管的端蓋，更換硅膠干燥劑。
更換干燥劑時應(yīng)該注意將脫脂棉全部放進管子里，保證對密封端面無任何影響，從而確保端蓋旋緊后能夠密封。
儀器工作不消耗KOH，但建議每半年更換電解液，更換電解液時，先抽出氮氣發(fā)生器中的廢堿液，加入蒸餾水，開動儀器，讓系統(tǒng)清洗電解系統(tǒng)約6-10分鐘，抽出蒸餾水加入配置好的新電解堿液。
一定要嚴(yán)格執(zhí)行開關(guān)機操作流程，在次使用發(fā)生器時，或者在更換干燥劑之后，必須將氮氣排空閥置于排空狀態(tài)2小時，確保干燥管內(nèi)空氣全部置換之后，再將手柄拔出。
每次關(guān)閉發(fā)生器電源后，請先打開發(fā)生器背后的儲氣罐排水閥，將空氣儲氣罐中的空氣排盡，空氣和氮氣壓力表降為0即可，然后關(guān)閉儲氣罐排水閥，將氮氣排空閥手柄向內(nèi)推，關(guān)機程序即完成。按此程序關(guān)機后，下一次開機排空時間可縮短至30分鐘，氮氣即可使用。

   氮氣發(fā)生器以空氣作為原料，以碳分子篩作為吸附劑，運用變壓吸附原理，利用碳分子篩對氧和氮的選擇性吸附而使氮和氧分離的方法，與傳統(tǒng)制氮法相比，它具有工藝流程簡單、自動化程度高、產(chǎn)氣快(16-30分鐘)、能耗低，產(chǎn)品純度可在較大范圍內(nèi)根據(jù)用戶需要進行調(diào)節(jié)，操作維護方便、運行成本較低、裝置適應(yīng)性較強等特點，故在1000Nm3/h以下的儀器中頗具競爭力，越來越得到中、小型氮氣用戶的歡迎，該儀器已成為中、小型氮氣用戶的理想選擇設(shè)備。
儀器是通過空氣壓縮機將外界的空氣收集到儲氣罐中，再將空氣通入電解分離池，氮氣和氧氣在電解池內(nèi)產(chǎn)生分離。氧氣被釋放到大氣中，氮氣經(jīng)過凈化、干燥后輸出，通過系統(tǒng)壓力可以自動調(diào)節(jié)氮氣輸出量。儀器可間斷使用，也可連續(xù)使用，且產(chǎn)氣純度不衰減。設(shè)有多級保護裝置，安全、可靠、穩(wěn)定。本儀器主要由電解系統(tǒng)、壓力控制系統(tǒng)和凈化系統(tǒng)組成。電解氫是采用膜分離技術(shù)，由紅外光電裝置控制壓力，可使氮氣的產(chǎn)量按需量自動調(diào)整，維持壓力穩(wěn)定。
為了確保氣體純度，氮氣發(fā)生器每工作1000小時，需要更換活性炭一次(活性碳為20-40目，鉛筆芯式)；工作過程中壓縮機不啟動，熱保護繼電器啟動，說明壓縮機溫度過高，待冷卻后即可自動恢復(fù)正常。
進氣口過濾器需定期清洗，周期視室內(nèi)粉塵情況而定，可用超聲波清洗，以保持進氣通暢，否則易引起壓縮機工作負(fù)載增大并發(fā)熱，溫度過高時會發(fā)生過熱保護而導(dǎo)致停機；
因壓縮機是感性負(fù)載，通斷電時的瞬時電流比正常工作時高數(shù)倍，較易熔斷保險，應(yīng)選用6A保險管。
由于該儀器配備的壓縮機為開路工作方式，故潤滑油會隨水排出機外，造成消耗，所以在使用一年后適當(dāng)給壓縮機加潤滑油，加油口在壓縮機出氣口旁邊或從進氣口亦可，建議加18號冷凍機油200克。
為避免機內(nèi)存水過多，影響空氣純度，所以每次關(guān)機前需按下排水開關(guān)數(shù)秒鐘即可。可將排水口接入塑料瓶中避免水外濺，每日排水不得少于一次。
干燥管應(yīng)定期更換，當(dāng)干燥管中的變色硅膠50%發(fā)生變色時，應(yīng)更換內(nèi)部填料。更換方法：關(guān)閉電源，并排空系統(tǒng)氣體。將凈化管按箭頭所指方向旋下，在旋下凈化管的端蓋，更換硅膠干燥劑。
更換干燥劑時應(yīng)該注意將脫脂棉全部放進管子里，保證對密封端面無任何影響，從而確保端蓋旋緊后能夠密封。
儀器工作不消耗KOH，但建議每半年更換電解液，更換電解液時，先抽出氮氣發(fā)生器中的廢堿液，加入蒸餾水，開動儀器，讓系統(tǒng)清洗電解系統(tǒng)約6-10分鐘，抽出蒸餾水加入配置好的新電解堿液。
一定要嚴(yán)格執(zhí)行開關(guān)機操作流程，在次使用發(fā)生器時，或者在更換干燥劑之后，必須將氮氣排空閥置于排空狀態(tài)2小時，確保干燥管內(nèi)空氣全部置換之后，再將手柄拔出。
每次關(guān)閉發(fā)生器電源后，請先打開發(fā)生器背后的儲氣罐排水閥，將空氣儲氣罐中的空氣排盡，空氣和氮氣壓力表降為0即可，然后關(guān)閉儲氣罐排水閥，將氮氣排空閥手柄向內(nèi)推，關(guān)機程序即完成。按此程序關(guān)機后，下一次開機排空時間可縮短至30分鐘，氮氣即可使用。

為了在恒溫?fù)u床中成功培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)物，需要溫和的混合、主動和衛(wèi)生的加濕，以避免蒸發(fā)和精確的 CO2調(diào)節(jié)，從而使培養(yǎng)基中的 pH 值更穩(wěn)定。此外，無菌在防止較長過程中的污染方面起著重要作用。

01 穩(wěn)定和均勻的條件

為了從細(xì)胞培養(yǎng)中獲得可重復(fù)的結(jié)果，在整個生物過程中必須有最 佳的培養(yǎng)條件。因此，針對細(xì)胞培養(yǎng)優(yōu)化的培養(yǎng)箱搖床提供了精確調(diào)節(jié) CO2供應(yīng)和空氣濕度的選項。加濕必須沒有冷凝水，以避免搖床損壞和污染。可靠且高度的溫度均勻性也很重要。

02 通過溫和混合實現(xiàn)最 佳氧合

與靜態(tài)培養(yǎng)箱不同，培養(yǎng)箱搖床確保細(xì)胞培養(yǎng)物的理想混合，從而為它們提供足夠的氧氣。具有低攪拌速度的相應(yīng)溫和驅(qū)動確保氧氣可用于對剪切敏感的細(xì)胞培養(yǎng)物。

03 細(xì)胞培養(yǎng)的衛(wèi)生環(huán)境

細(xì)胞培養(yǎng)中的污染會耗費大量時間和金錢。因此，用于細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)箱具有特殊功能，可將污染風(fēng)險降至最低。理想情況下，搖床配備額外的衛(wèi)生功能、抗 菌涂層和紫外線輻射。選擇恒溫?fù)u床時，請確保它可以快速徹底地清潔及包含泄漏到內(nèi)部的液體。

04 智能設(shè)計縮短培養(yǎng)中斷時間

即使是最輕微的條件變化也會損壞細(xì)胞。在實踐中，這意味著盡可能少地打開恒溫?fù)u床的門，并盡可能縮短必要的中斷時間。因此，可以快速操作的門結(jié)構(gòu)以及快速的自動啟停是重要的功能。此外，用戶應(yīng)該能夠輕松操作，且符合人體工程學(xué)。

05 符合 GMP 的文檔和全面的報告

恒溫?fù)u床可根據(jù)客戶要求進行鑒定：工廠驗收測試 (FAT) 和現(xiàn)場驗收測試 (SAT)、安裝驗證 (IQ) 和操作驗證 (OQ)。一個生物過程軟件記錄了整個培養(yǎng)過程，此外還可以在較長時間內(nèi)進行自動監(jiān)控和調(diào)節(jié)。