導(dǎo)論
乳糖操縱子（lacO）是一組埃希氏菌屬大腸桿菌基因， 負(fù)責(zé)細(xì)菌中的乳糖代謝。乳糖阻遏物對它的調(diào)節(jié)是分子生物學(xué)中一個被充分研究的系統(tǒng)。而乳糖阻遏物這一個DNA 結(jié)合蛋白（lacI）是控制乳糖操縱子的關(guān)鍵。 該系統(tǒng)的平衡解離常數(shù)（KD）通常估計在 nM 范圍內(nèi)。 

這種 lacO / lacI 系統(tǒng)通常在本科基因調(diào)控的生物化學(xué)和生物學(xué)課程中引入。更高級關(guān)于 lacO / lacI 的研究包括成像和染色質(zhì)編輯中的應(yīng)用。 

在更廣泛的領(lǐng)域里，SPR 對蛋白質(zhì)-DNA 復(fù)合物研究在理解基因表達(dá)調(diào)節(jié)途徑中有相當(dāng)重要的地位。
在這篇應(yīng)用筆記我們將分享蒙特利爾大學(xué)學(xué)術(shù)實驗室如何使用 P4SPR 來確定 lacO / lacI 系統(tǒng)的結(jié)合強(qiáng)度（親和力，KD）。實驗室技術(shù)人員通過易用的 P4SPR 和相應(yīng)的用戶界面來開發(fā) SPR 測定，以便于在本科實驗課程中演示該生物系統(tǒng)。

圖1 乳糖操縱子與乳糖阻遏蛋白組合

實驗裝置

系統(tǒng)設(shè)置

圖2 臺式P4SPR設(shè)置

USB 供電的 P4SPR 可以連接到筆記本電腦，通過 P4SPR控制軟件啟動操作控制和數(shù)據(jù)記錄。易于使用的界面讓用戶可以輕松設(shè)置 P4SPR。 首先，把微流體單元（圖3）蓋在金傳感器芯片上并緊密固定在傳感器芯片腔中。然后在樣品和參比通道中注入溶液以穩(wěn)定基線。 S 形樣品通道具有 3 個平行的感應(yīng)區(qū)域，其可以提供一式三份的樣品測量以及與參考通道的一次控制測量。 通過透明通道可以在直接觀察在通道中是否有形成的氣 泡，以便立即清除而防止任何信號丟失。

圖3 P4SPR微流體單元

實驗步驟

在達(dá)到基線穩(wěn)定后，將硫醇化的 LacO DNA 注入樣品通道。 固定化自發(fā)地造成強(qiáng)金-硫鍵形成，直到 SPR 表面飽和后產(chǎn)生平臺信號。 然后注射互補(bǔ)的 LacO 寡聚體以允許雜交。在結(jié)合測定之前徹底洗滌傳感器表面。 通過先前儲備的液蛋白溶液來制備 5, 20, 50, 100 和200nM 的溶液。 依次注入每種逐漸增加濃度的溶液， 并用其中的大量洗滌溶液和再生緩沖液孵育 10 分鐘，以從先前溶液中除去剩余的 LacI 蛋白。記錄來自所有4 個通道的數(shù)據(jù)，然后導(dǎo)出到 Excel 進(jìn)行進(jìn)一步的數(shù)據(jù)分析。
 
結(jié)果和討論
在該實驗中，從樣品通道得到 3 條平行結(jié)合曲線。 對該信號進(jìn)行平均后從參考信道信號中減去來取得 SPR 信號相對于時間繪制（圖 5）。使用不同濃度的結(jié)合位移來建立結(jié)合等溫線，從而確定 KD（圖 6）。
計算的 KD 為 6.4±1.2nM，符合相關(guān)低濃度基于 LacI 的轉(zhuǎn)錄YZ蛋白的文獻(xiàn)報道值1。值得注意的是，與已發(fā)表論文中使用的 DNA 結(jié)合分析相比，SPR 分析不需要任何 DNA 放射性標(biāo)記，并且可實時監(jiān)測結(jié)合相互作用。

P4SPR 優(yōu)勢
P4SPR 獨(dú)特的模塊式，便攜和多通道設(shè)計使其成為用于藥物發(fā)現(xiàn)，生物/傳感和系統(tǒng)集成應(yīng)用的靈活臺式 SPR 工具。 它幾乎不需要樣品制備，使得系統(tǒng)設(shè)置快速簡單，同時節(jié)省了用戶在純化試劑盒和試劑上的成本。此外，P4SPR 利用薄膜 SPR 的高靈敏度和更深的穿透深度來準(zhǔn)確測量和結(jié)合的親和力。

總結(jié)
P4SPR 成功地展出乳糖操縱子 DNA 與其阻遏蛋白的結(jié)合相互作用，并且數(shù)據(jù)可從之前發(fā)表的文獻(xiàn)驗證。 本科生可從該實驗熟悉該 SPR 技術(shù)及其在監(jiān)測生物分子相互作用中的應(yīng)用。 此外，P4SPR 系統(tǒng)也可考察其他生物系統(tǒng)，如 DNA-DNA，RNA 以及適體對，可以幫助科研人員更好地了解結(jié)合并揭示生物通路中的功能。
 
致謝
我們要感謝 Philipe Lampron，Shona Teijeiro 和蒙特利爾生物化學(xué)大學(xué)的 SébastienTruche 開發(fā)該化驗。
 
關(guān)于 Affinité Instruments
Affinité Instruments 成立于 2015 年，是一個從蒙特利爾大學(xué)衍生的企業(yè)。Affinité Instruments 的創(chuàng)始人在 SPR 領(lǐng)域積累了十多年豐富的研究結(jié)果的知識，并通過多元化的商業(yè)，科學(xué)和工程領(lǐng)域經(jīng)驗將創(chuàng)新的 SPR 技術(shù)商業(yè)化。

參考文獻(xiàn)
1 Tungtur et al. Reconciling in vitro and in vivo activities of engineered, LacI3 based repressor proteins:Contributions of DNA looping and 4 operator sequence variation. doi: https://doi.org/10.1101/477893