在之前發(fā)表的文章《實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，你選對(duì)了嗎?》中提到，實(shí)時(shí)熒光定量PCR常用的方法包括了SYBR Green染料法、TaqMan探針法、分子信標(biāo)、熒光共振能量傳遞(FRET)和LUX Primers等。那么應(yīng)用最為廣泛的則是SYBR Green染料法和TaqMan探針法，兩者各有所長。今天，先給大家介紹TaqMan探針法，它優(yōu)秀在哪里？

TaqMan 探針法

最關(guān)鍵的Taqman探針，是一條與靶序列特異性結(jié)合的寡核苷酸序列，其能夠結(jié)合到正反向引物結(jié)合區(qū)域的中間部位，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，DNA聚合酶在延伸到探針位置時(shí)會(huì)將其水解，從而釋放熒光基團(tuán)，擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生信號(hào)。

TaqMan探針法的優(yōu)勢

?  高特異性，只有在探針和靶標(biāo)基因之間發(fā)生特異性的水解，才會(huì)生成熒光信號(hào)。

?  多重分析，可選擇不同的報(bào)告基因染料標(biāo)記探針，在一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)擴(kuò)增并檢測多個(gè)不同的序列。

?  無需PCR后處理，減少分析工作量并節(jié)省材料成本。

探針序列的設(shè)計(jì)原則

1. TaqMan探針的長度zuihao不超過30bp。理想情況下，有15bp可獲得ZJ特異性；

2. Tm值在67℃-72℃之間，確保探針的Tm值比引物的高5-10℃，在退火過程中優(yōu)先結(jié)合到模板上；

3. 探針序列的GC含量在20％至80％之間，避免多個(gè)重復(fù)的堿基出現(xiàn)，尤其要避免4個(gè)或超過4個(gè)的G堿基；

4. 探針盡量避免出現(xiàn)二聚體或者發(fā)夾結(jié)構(gòu)，以保證足夠高的模板結(jié)合效率；

5. 探針5’端不能為G，因?yàn)榧词箚蝹€(gè)G堿基與FAM熒光報(bào)告基團(tuán)相連時(shí)，G也可以淬滅FAM基團(tuán)所發(fā)出的熒光信號(hào)，從而導(dǎo)致假陰性的出現(xiàn)。

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如何選擇熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)

修飾基團(tuán)的選擇是探針法的重要環(huán)節(jié)，那么我們需要注意以下幾項(xiàng)：

1. 根據(jù)熒光定量PCR儀熒光通道，選擇適配的熒光基團(tuán)，優(yōu)先選擇常用的熒光基團(tuán)，如FAM、VIC或CY5等；

2. 根據(jù)熒光基團(tuán)類型選擇淬滅基團(tuán)。早期的淬滅基團(tuán)TAMRA，自身會(huì)發(fā)出熒光信號(hào)，干擾檢測結(jié)果，后續(xù)慢慢地被其他淬滅基團(tuán)替代。目前淬滅基團(tuán)最常用的就是BHQ、NFQ-MGB或QSY等；

3. 進(jìn)行多重qPCR檢測時(shí)，每個(gè)通道要選擇不同的熒光基團(tuán)，且避免各標(biāo)記基團(tuán)的激發(fā)和發(fā)射波長重疊，出現(xiàn)熒光干擾的情況。

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?  應(yīng)用靈活性

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?   流程智能化

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?   交互靈活性

主機(jī)可獨(dú)立運(yùn)行qPCR程序，電腦、Wi-Fi、網(wǎng)絡(luò)交互。

體積電阻率的計(jì)算和體積電阻值、電極尺寸、試樣厚度有關(guān)系，表面電阻率的計(jì)算主要和電極尺寸有關(guān)系

體積電阻與表面電阻讀數(shù)取值

體積電阻：

按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB1410標(biāo)準(zhǔn)中第11.1說明規(guī)定：在試樣表面加上規(guī)定的直流電壓后開始計(jì)時(shí)，并在如下每個(gè)電化時(shí)間做一次測量：1min、2min、5min、10min、50min、100min。如果兩次連續(xù)測量得出同樣的結(jié)果，則可以結(jié)束試驗(yàn)并用這個(gè)電流值來計(jì)算體積電阻。

作為驗(yàn)收試驗(yàn)，按照有關(guān)規(guī)范的規(guī)定，使用一個(gè)固定的電化時(shí)間如1min后的電流值來計(jì)算體積電阻率。

表面電阻：

按照GB1410標(biāo)準(zhǔn)11.2中規(guī)定：應(yīng)在1min的電化時(shí)間后測量電阻，即使在此時(shí)間內(nèi)電流還沒有達(dá)到穩(wěn)定的狀態(tài)。

測量次序

將直流電壓施加在試樣上,會(huì)改變其隨后測量的工頻 tan6的結(jié)果。

當(dāng)在同一試樣上相繼測量電容率、損耗因數(shù)和電阻率時(shí),工頻下測量應(yīng)在對(duì)試樣施加直流電壓以前進(jìn)行。工頻試驗(yàn)后,應(yīng)將兩電極短路1min后再開始測量電阻率。

導(dǎo)致錯(cuò)誤結(jié)果的因素

雖然只有嚴(yán)重污染才會(huì)影響電容率。但微量的污染卻能強(qiáng)烈地影響 tan 和電阻率。

不可靠的結(jié)果通常是由于不適當(dāng)?shù)娜踊蛱幚碓嚇铀斐傻奈廴?、由未洗凈試?yàn)池或吸收了水份, 特別是存在不溶解的水份所引起。

在貯藏期間長久暴露在強(qiáng)光線下會(huì)導(dǎo)致電介質(zhì)劣化,采用所推薦液體樣品貯存和運(yùn)輸以及試驗(yàn)池的結(jié)構(gòu)和凈化的標(biāo)準(zhǔn)化程序,可使由污染引起的誤差減至*小