DNA甲基化(DNA methylation)是指在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下，在基因組CpG二核苷酸的胞嘧啶5'碳位共價(jià)鍵結(jié)合一個(gè)甲基基團(tuán)。為DNA化學(xué)修飾的一種形式，能夠在不改變DNA序列的前提下，改變遺傳表現(xiàn)。DNA甲基化能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而控制基因表達(dá)。

Nature上一項(xiàng)新的研究揭示了一種跨染色質(zhì)調(diào)節(jié)途徑，即NSD1（一種組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶）介導(dǎo)的H3K36me2是在基因間區(qū)域招募DNMT3A和維持DNA甲基化所必需的，并將異常的基因間CpG甲基化與人類(lèi)腫瘤生長(zhǎng)和過(guò)度發(fā)育相關(guān)聯(lián)在一起。

作者發(fā)現(xiàn)了一個(gè)有趣的現(xiàn)象：塔頓布朗拉赫曼綜合征(Tatton–Brown–Rahman syndrome, TBRS)是一種兒童過(guò)度生長(zhǎng)障礙，是由生殖系統(tǒng)DNMT3A（DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A）突變導(dǎo)致的。兒童期巨腦畸形綜合征(Sotos syndrome)是由NSD1（組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶）的單倍劑量不足引起的。這兩種疾病具有相同的臨床特征，這就非常有意思了：這預(yù)示著組蛋白修飾和DNA甲基化修飾可能存在機(jī)制上的關(guān)聯(lián)性。

首先，研究人員通過(guò)全基因組分析和ChIP-seq分析方法發(fā)現(xiàn)，組蛋白甲基化修飾H3K36me2和H3K36me3的富集區(qū)域非常類(lèi)似，且明顯區(qū)別于其他組蛋白甲基化修飾如H3K9me3和H3K27me3所劃分的區(qū)域。而且H3K36me2和H3K36me3水平與CpG甲基化呈正相關(guān)，這與之前報(bào)道的H3K36me3介導(dǎo)靶向DNMT3B的活性一致。然而，由于這種相互作用于基因小體，染色質(zhì)水平上的調(diào)控機(jī)制并不清楚。

在進(jìn)一步的檢測(cè)和比較全基因組分析，發(fā)現(xiàn)H3K36me3在基因體中表現(xiàn)出特征性的富集，而H3K36me2則表現(xiàn)出更為彌散的分布，包括基因區(qū)和基因間區(qū)。與H3K36me3相比，DNMT3A選擇性富集在H3K36me2高水平區(qū)域。

接下來(lái)，就是我們的獨(dú) 家法寶Alpha技術(shù)大顯身手的時(shí)候了。研究人員采用體外高靈敏度、勻相免疫AlphaLISA技術(shù)來(lái)闡明H3K36me2介導(dǎo)的DNMT3A募集特異性背后的機(jī)制。首先GST標(biāo)記DNMT3A，純化后將GST-DNMT3A與生物素化的核小體（不同甲基化的H3K36）置于384孔板。依次加入谷胱甘肽受體微珠，鏈霉親和素供體微珠。避光反應(yīng)60min后置于Envision多模式讀板儀中對(duì)信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)。

通過(guò)親和曲線分析可得知，DNMT3A與H3K36me2修飾的核小體的親和力Z高，其次是H3K36me3，但不與其他價(jià)態(tài)結(jié)合。這些結(jié)果表明DNMT3A可以識(shí)別H3K36兩種甲基化狀態(tài)，但對(duì)H3K36me2的親和力更強(qiáng)。

同時(shí)，作者也在體外NSD1突變細(xì)胞和臨床Sotos綜合癥病人的血樣本中驗(yàn)證組蛋白H3K36甲基化與DNA甲基化修飾的相關(guān)性，揭示DNMT3A優(yōu)先選擇H3K36二甲基化區(qū)域，促進(jìn)基因間區(qū)的DNA甲基化。這一機(jī)制在疾病發(fā)生過(guò)程中有潛在的生物學(xué)意義。

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參考文獻(xiàn)

Weinberg D N, Papillon-Cavanagh S, Chen H, et al. The histone mark H3K36me2 recruits DNMT3A and shapes the intergenic DNA methylation landscape[J]. Nature, 2019, 573(7773): 281-286.

Dor Y, Cedar H. Principles of DNA methylation and their implications for biology and medicine[J]. Lancet. 2018

阿爾茲海默氏?。ˋlzheimer disease，AD）是一種進(jìn)行性疾病，涉及大腦神經(jīng)元退化，并導(dǎo)致各種癥狀，Z顯著的是記憶力喪失?？茖W(xué)家們多年來(lái)一直致力于在此疾病的發(fā)病機(jī)制、診斷、ZL等方面開(kāi)展研究，力求解決這個(gè)威脅人類(lèi)健康安全的世紀(jì)難題。

β-粥樣淀粉一直被科學(xué)家認(rèn)為是Alzheimer's disease (AD)疾病的起因。而γ分泌酶作為一種膜蛋白酶，可以直接或間接的產(chǎn)生各種amyloid peptide (Aβ) ，所以以γ分泌酶為靶點(diǎn)的機(jī)制和應(yīng)用研究也Z多。Presenilin早老素，作為γ-secretase四個(gè)亞基之一的催化亞基，負(fù)責(zé)β-amyloid (Aβ)肽的產(chǎn)生，超過(guò)200 Alzheimer’s 疾病相關(guān)的突變?cè)趐resenilin 1 (PS1) and PS2中被確認(rèn)。但有趣且有爭(zhēng)議的是，這些相關(guān)的AD疾病突變?cè)讦?secretase其他三個(gè)亞基中并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)。這預(yù)示著早老素有別于γ-secretase的其他功能。為證實(shí)這一假設(shè)，找到與PS結(jié)合蛋白是非常重要的一步。

Alzheimer 新突破

近來(lái)，清華大學(xué)施一公團(tuán)隊(duì)在阿爾茲海默病發(fā)病機(jī)制上又有了新突破：首次發(fā)現(xiàn)可與Presenilin相互作用并具有水解功能的蛋白Bax-inhibitor 1 (BI1)。

研究發(fā)現(xiàn)，Bax-inhibitor 1 (BI1)，是一個(gè)進(jìn)化保守的跨膜蛋白，可以穩(wěn)定與PS1結(jié)合，但不與具完整亞基結(jié)構(gòu)的γ-secretase結(jié)合。加入底物APP-C99，通過(guò)AlphaLISA檢測(cè)Aβ40和Aβ42的產(chǎn)生情況，來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證BI1的細(xì)胞功能。發(fā)現(xiàn)PS1–BI1復(fù)合物不具備水解酶活性。在等摩爾濃度下，BI1對(duì)γ-secretase的蛋白水解活性沒(méi)有影響，但在將BI1提高200倍摩爾的條件下，γ-secretase蛋白水解活性減少了一半。

AlphaLISA方法檢測(cè)PS1–BI1復(fù)合物對(duì)APP-C99的水解活性

這直接預(yù)示了PS1除了參與γ-secretase外，可能還具有其他的細(xì)胞功能。BI1是一種被認(rèn)為在細(xì)胞凋亡和鈣通道調(diào)控中起作用的蛋白，此研究結(jié)果直接將PS1與BI1聯(lián)系起來(lái)，這一發(fā)現(xiàn)為研究PS1的功能和AD的發(fā)生提供了更多的可能性。

檢測(cè)理想之選AlphaLISA

AlphaLISA勻相檢測(cè)體系的突出特點(diǎn)是高通量、高信噪比、均相免洗、抗干擾能力強(qiáng)，操作簡(jiǎn)單。在體外、細(xì)胞、組織等水平的檢測(cè)中，都顯示出傳統(tǒng)檢測(cè)方法無(wú)法媲美的zhuo越性能。

ALPHA的方法采用單體氧作為能量擴(kuò)散的載體，其擴(kuò)散距離可以達(dá)到200nm，發(fā)光原理為化學(xué)反應(yīng)發(fā)光，具有背景干凈、信噪比高的特點(diǎn)，因此更適合于復(fù)雜樣品的檢測(cè)，如組織液、血清、組織裂解液等，步驟少、方法簡(jiǎn)單、均相反應(yīng)、不需要洗滌，因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果質(zhì)量更高。同時(shí)推薦選擇具有HTS ALPHA檢測(cè)模塊的多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行抗體的篩選，可以大大縮短檢測(cè)時(shí)間。

使用ALPHA的方法進(jìn)行Aβ的檢測(cè)是理想之選，可以通過(guò)商品化的Aβ檢測(cè)劑盒檢測(cè)Aβ的量：

Amyloid β 1-15

Amyloid β 1-40 (human)

Amyloid ? 1-40 (mouse/rat)

Amyloid β 1-42 (human)

Amyloid β 1-42 (mouse/rat)

Amyloid β 1-x

Amyloid β oligomers

Total or oligomerized Aβ 42 (Two in one)

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參考文獻(xiàn)

1. Wu S, Song W, Wong CCL，et al.,(2019).Bax inhibitor 1 is a γ-secretase–independent presenilin-binding protein. Proc Natl Acad Sci U S A. Jan 2;116(1):141-147.

2. Stéphanie Chasseigneaux,et al.,(2012). Functions of Aβ, sAPPα and sAPPβ : similarities and differences. J. Neurochem. 120 (Suppl. 1), 99–108.

3. Ting-Hai Xu, Yan Yan, Yanyong Kang, et al., (2016). Alzheimer’s disease-associated mutations increase amyloid precursor protein resistance to γ-secretase cleavage and the Aβ42/Aβ40 ratio. Cell Discovery. 2, 16026.

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大部分化療藥物如鉑類(lèi)藥物等，都是通過(guò)破壞腫瘤細(xì)胞中的DNA來(lái)YZ細(xì)胞的生長(zhǎng)，從而達(dá)到治LX果。然而，“聰明”的腫瘤可以采用另一種替代性的DNA跨損傷合成(translesion synthesis,TLS)途徑來(lái)完成復(fù)制并獲得耐藥性。針對(duì)TLS的靶向化ZL是非常有前景的開(kāi)發(fā)方案。

來(lái)自麻省理工學(xué)院和杜克大學(xué)的研究人員發(fā)現(xiàn)一種可阻斷TLS途徑的小分子化合物并發(fā)表在CELL上。同時(shí)，用這種化合物和順鉑聯(lián)合ZL體外腫瘤細(xì)胞和荷瘤小鼠時(shí)，都有顯著的效果。

這樣有臨床應(yīng)用潛力的明星分子是如何被發(fā)現(xiàn)的呢？

在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，TLS的發(fā)生包括兩個(gè)步驟，首先插入TLS DNA聚合酶，如POL kPOL i、POL h或REV1，在損傷處引入一個(gè)核苷酸；接下來(lái)是募集b族聚合酶復(fù)合物POL z (POL z4: REV3L/REV7/POLD2/POLD3)進(jìn)行3’端的延伸。而其中起主要作用的是約100個(gè)氨基酸的REV1 C-terminal domain (CTD)，它可以招募插入TLS的其他聚合酶POL k、POL i和POL h，并通過(guò)與REV7的相互作用來(lái)招募POL z。

基于此，作者首先分別構(gòu)建了His8-tagged REV7/3和FLAG-tagged POL k RIR-REV1 CTD表達(dá)系統(tǒng)并對(duì)融合蛋白進(jìn)行純化，然后基于ELISA方法對(duì)化合物庫(kù)中高達(dá)~10000種化合物進(jìn)行篩選，并將目標(biāo)鎖定了JH-RE-06。

然后作者采用高靈敏定量AlphaScreen技術(shù)，通過(guò)抗FLAG供體微珠、抗His受體微珠構(gòu)建勻相反應(yīng)體系，進(jìn)一步確定了化合物JH-RE-06對(duì)REV1-REV7的阻斷作用，并得出了其IC50值為0.78 mM。

隨后，作者在分別在多種人類(lèi)癌細(xì)胞和人類(lèi)黑色素瘤小鼠模型上進(jìn)行了驗(yàn)證，證實(shí)此化合物可以提高癌細(xì)胞對(duì)順鉑類(lèi)化合物的敏感性和長(zhǎng)期化療的有效性，并對(duì)其他以DNA為作用靶標(biāo)的類(lèi)似藥物，都有同樣的類(lèi)似效果。

作者用清晰的思路論述了篩選和驗(yàn)證化合物的過(guò)程，并進(jìn)一步討論了化合物耐藥性機(jī)制：JH-RE-06能與Rev1結(jié)合并生成二聚體，而一旦形成這樣的二聚體結(jié)構(gòu)，則不能與Rev3 / Rev7 TLS DNA聚合酶結(jié)合，直接阻止了TLS的發(fā)生和癌細(xì)胞的快速?gòu)?fù)制，同時(shí)，也更進(jìn)一步制止了突變產(chǎn)生的可能性，避免了癌細(xì)胞獲得耐藥性。

在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，采用ALPHA技術(shù)對(duì)初篩得到的化合物JH-RE-06的功能驗(yàn)證是非常重要的一步：

ALPHA的方法采用單體氧作為能量擴(kuò)散的載體，其擴(kuò)散距離可以達(dá)到200nm，發(fā)光原理為化學(xué)反應(yīng)發(fā)光，具有背景干凈、信噪比高的特點(diǎn)，同樣適合于復(fù)雜樣品的檢測(cè)，如組織液、血清、組織裂解液等，步驟少、方法簡(jiǎn)單、均相反應(yīng)、不需要洗滌，因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果質(zhì)量更高。同時(shí)推薦選擇具有HTS ALPHA檢測(cè)模塊的多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行抗體的篩選，可以大大縮短檢測(cè)時(shí)間。

參考文獻(xiàn)

Jessica L. Wojtaszek, Nimrat Chatterjee, et al. ;(2019).A Small Molecule Targeting Mutagenic Translesion Synthesis Improves Chemotherapy. Cell. 178, 1–8,June 27

    在今日《科學(xué)》的論文中，André Nussenzweig研究團(tuán)隊(duì)以有絲***后的神經(jīng)元和巨噬細(xì)胞為研究體系，發(fā)現(xiàn)DNA主動(dòng)去甲基化對(duì)于增強(qiáng)子激活是必要的，并且解釋了神經(jīng)元和巨噬細(xì)胞增強(qiáng)子上DNA單鏈損傷的來(lái)源以及闡述其中的機(jī)制。

    據(jù)研究者介紹，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，5-甲基胞嘧啶（5mC）是***主要的DNA修飾，它對(duì)于發(fā)育和細(xì)胞分化有重要作用。5mC可被TET酶氧化為5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)、5-甲?；奏ぃ?fC）和5-羧基胞嘧啶（5caC），引起DNA去甲基化。

    在DNA主動(dòng)去甲基化過(guò)程中，5fC和5caC被胸腺嘧啶DNA糖基化酶（TDG）切除產(chǎn)生無(wú)堿基位點(diǎn)，并后續(xù)產(chǎn)生DNA單鏈損傷。其能通過(guò)堿基切除修復(fù)（BER）途徑***終修復(fù)轉(zhuǎn)化為C堿基。

    根據(jù)過(guò)往研究數(shù)據(jù)，研究者推測(cè)單鏈DNA損傷可能與TET-TDG介導(dǎo)的5fC/5caC切除有關(guān)。利用細(xì)胞工程獲得的興奮性神經(jīng)元（iNeuron），研究者降低了細(xì)胞TDG水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)此行為可讓神經(jīng)元中可以積累大量的5fC/caC。

    隨后，研究者利用課題組開(kāi)發(fā)的DNA單鏈損傷檢測(cè)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，降低TDG水平幾乎消除了DNA單鏈損傷。這也說(shuō)明，神經(jīng)元中DNA單鏈損傷來(lái)源于TDG依賴的DNA主動(dòng)去甲基化。

▲研究示意圖（圖片來(lái)源：Active DNA demethylation damages DNA，DOI: 

    除了在神經(jīng)細(xì)胞增強(qiáng)子上觀察到重復(fù)出現(xiàn)的DNA損傷修復(fù)事件，研究者還使用了由前體B細(xì)胞轉(zhuǎn)分化來(lái)源的巨噬細(xì)胞作為測(cè)試對(duì)象。通過(guò)CRISPR/Cas9敲除TET2和TDG蛋白，研究者也在巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了主動(dòng)去甲基化引起的DNA單鏈損傷和修復(fù)過(guò)程。

    不過(guò)兩者也有著略微的區(qū)別，巨噬細(xì)胞偏好使用短補(bǔ)丁堿基切除修復(fù)（short-patch BER）以填補(bǔ)單核苷酸斷裂缺口，而神經(jīng)元會(huì)同時(shí)使用長(zhǎng)補(bǔ)丁堿基切除修復(fù) （long-patch BER）和短補(bǔ)丁堿基切除修復(fù)。

    根據(jù)論文，TDG缺失不會(huì)影響巨噬細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞的分化，卻會(huì)在分化過(guò)程中讓數(shù)千種基因的表達(dá)發(fā)生變化。這對(duì)細(xì)胞的行為是有影響的，例如TDG缺失削弱了巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌的能力。而TDG被敲除，會(huì)部分影響神經(jīng)元分化成熟相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)，包括神經(jīng)突觸前信號(hào)通路調(diào)控的相關(guān)基因。

    研究者指出，新研究發(fā)現(xiàn)的機(jī)制對(duì)于腫瘤治有一定啟示意義。在DNA 主動(dòng)去甲基化過(guò)程中，若使用抗腫瘤胞嘧啶類(lèi)似物（Ara-C）中斷DNA修復(fù)會(huì)觸發(fā) TDG 依賴性DNA損傷應(yīng)答和神經(jīng)元死亡，這表明神經(jīng)元在正常分化和分化成熟后內(nèi)在的生理活動(dòng)可能會(huì)導(dǎo)致化療造成的神經(jīng)損傷。

    André Nussenzweig課題組博士后王東鵬，吳薇（兼共同通訊作者，現(xiàn)為中科院分子細(xì)胞科學(xué)***創(chuàng)新中心研究員）和研究科學(xué)家Elsa Callen為該論文的共同***作者。

    現(xiàn)階段核酸檢測(cè)是分析疾病的重要手段，洛陽(yáng)吉恩特生物giant-bio自主研發(fā)生產(chǎn)的納米核酸提取磁珠（DNA/RNA提取磁珠） 磁響應(yīng)時(shí)間迅速，提取效率高，可明顯縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提高實(shí)驗(yàn)效率，并在提取結(jié)果上保持穩(wěn)定,另外羧基磁珠和氨基磁珠也是制作免疫磁珠的重要原料。