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  無處不在12138 2009-05-01 00:00:00

  對于小鼠來說，質(zhì)粒只存在于線粒體中 質(zhì)粒提取可分為三個部分 1 裂解細(xì)胞 2 質(zhì)粒DNA與染色體DNA的分離 3 純化 這里找到一篇論文： 小鼠CD40Ig基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 1 材料和方法 1.1 實(shí)驗(yàn)動物 Balb-c小鼠，6周齡， 雌性， 購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物部。 1.2 質(zhì)粒、菌株、細(xì)胞株和主要試劑 質(zhì)粒pEGFP-N1、pGEM-T載體質(zhì)粒、E coli.DH5a（天根公司）。低代次HEK293細(xì)胞株（本元正陽）。AdMaxTM Kit E試劑盒（Microbix Biosystems，Inc.）。Taq酶、T4 DNA連接酶（Takara公司）。限制性核酸內(nèi)切酶XmaⅠ、Bgl II、Hind III（Biolabs）。Trizol 試劑、Lipofectamine 2000（Invitrogen）。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR Master Mix（MBI）。質(zhì)粒提取、膠純化試劑盒（QIAGEN）。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶（Gibco）。引物合成由上海生工公司完成，基因測序由北京諾塞基因研究ZX有限公司完成。 1.3 構(gòu)建小鼠CD40Ig基因真核表達(dá)質(zhì)粒 1.3.1 小鼠總RNA的提取：將小鼠以頸椎脫臼法處死，取出，加入液氮研磨后，用Trizol試劑提取總RNA，方法按產(chǎn)品說明進(jìn)行。 1.3.2 CD40、IgG2a Fc、GFP基因的制備：以小鼠總RNA為模板，oligo-dT為引物，RT-PCR合成cDNA，再以此cDNA為模板，用CD40和mIgG Fc特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，另以pEGFP-N1質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物及PCR反應(yīng)條件見表1，分別獲得CD40、mIgG2a Fc和GFP基因。 1.3.3 質(zhì)粒pGEM-IgG的構(gòu)建：將IgG Fc的PCR產(chǎn)物與pGEM-T質(zhì)粒進(jìn)行TA連接反應(yīng)，即10μl PCR產(chǎn)物加2μl的pGEM-T載體加10 U的T4連接酶，16 ℃過夜。取2μl的連接產(chǎn)物以氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，用藍(lán)白斑方法挑選含氨芐青霉素抗性的白斑克隆，在3 ml LB培養(yǎng)基（含氨芐青霉素100 μg/ml）中37 ℃、80 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒pGEM-IgG并測序。 1.3.4 質(zhì)粒p516-IgG的構(gòu)建：用Bgl II分別消化pGEM-IgG和pDC516，產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行膠純化。將IgG片段和pDC516線性載體按7:1的摩爾濃度比例加T4連接酶16 ℃過夜進(jìn)行連接反應(yīng)。取5μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，用pDC516-f和mIgG-r引物組合進(jìn)行菌落PCR篩選正向插入的重組子（見表2），將PCR陽性的重組子進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并測序。 1.3.5 質(zhì)粒p516-CD40-IgG融合基因的構(gòu)建：用Xma I分別消化CD40的PCR產(chǎn)物和p516-IgG，將CD40片段和pDC516-IgG 線性載體進(jìn)行連接（方法同上）。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后，用pDC516-f和CD40-r引物組合進(jìn)行菌落PCR篩選（見表2），將陽性結(jié)果的重組子進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并測序。 1.3.6 PDC516-CD40-IgG-GFP質(zhì)粒的構(gòu)建：用Hind Ⅲ分別消化GFP的PCR產(chǎn)物和pDC516-CD40-IgG，將GFP片段和pDC516-CD-IgG 線性載體進(jìn)行連接反應(yīng)（方法同上），用GFP-f和pDC516-r引物組合進(jìn)行菌落PCR篩選正向插入的重組子（見表2），提取質(zhì)粒并測序。 1.3.7 PDC516-CD40-IgG-GFP質(zhì)粒的大量制備：按QIAGEN EndoFree Plasmid Purification試劑盒說明進(jìn)行制備，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)（見圖2），紫外分光光度儀測OD值，過濾CJ后-20 ℃保存?zhèn)溆谩? 1.3.8 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞：在6孔板中將2.0×105個細(xì)胞接種于2 ml含血清不含抗生素的DMEM中，在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染時鋪滿平板的60%～70%。用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，在無菌EP管中準(zhǔn)備A、B兩種溶液。A液：將4.0μg DNA溶于250μl無血清DMEM中，輕輕混勻；B液：將10μl Lipofectamine 2 000溶于250μl無血清培養(yǎng)液中，輕輕混勻，室溫孵育5 min。將A液和B液混合并混勻，室溫孵育20 min，以形成脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物。換去6孔板中舊的培養(yǎng)液，重新加入2 ml含血清不含抗生素的DMEM，逐滴加入500μl脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物。在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后換液。 2 結(jié)果 2.1 獲得小鼠CD40胞外區(qū)、IgG2a Fc段及GFP基因 引物CD40-f和CD40-r經(jīng)PCR擴(kuò)增的小鼠CD40胞外區(qū)基因片段為572 bp；引物mIgG-f和mIgG-r經(jīng)PCR擴(kuò)增的小鼠IgG2a Fc段為700 bp；引物GFP-f和GFP-r經(jīng)PCR擴(kuò)增的GFP基因片段為765 bp。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1。 2.2 pDC516-CD40-IgG-GFP真核表達(dá)質(zhì)粒的成功構(gòu)建 2.2.1 pDC516-IgG的構(gòu)建：pGEM-T載體為3 000 bp的質(zhì)粒，構(gòu)建的pGEM-IgG質(zhì)粒為3 700 bp。pGEM-T質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)上游110 bp處含有T7 Primer序列，用T7+mIgG-r引物組合可擴(kuò)增出約810 bp的片段，用T7 primer測序證實(shí)IgG序列的正確性。將IgG片段和pDC516線性載體進(jìn)行連接反應(yīng)，用pDC516-f測序證實(shí)IgG插入序列的正確性（見圖3）。 2.2.2 pDC516-CD40-IgG的構(gòu)建：將CD40片段和pDC516-IgG線性載體進(jìn)行連接反應(yīng)，用引物pDC516-f測序證實(shí)CD40插入序列的正確性。 2.2.3 pDC516-CD40-IgG-GFP質(zhì)粒的構(gòu)建：將GFP片段和pDC516-CD40-IgG 線性載體進(jìn)行連接反應(yīng)，用pDC516-r測序證實(shí)GFP插入序列的正確性。CD40-IgG-GFP含酶切位點(diǎn)的融合產(chǎn)物為2001bp，編碼667aa（見圖4）。 2.3 重組質(zhì)粒在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá) pDC516-CD40-IgG-GFP質(zhì)粒抽提后在紫外分光光度計(jì)下檢測到OD值為0.1257。將該質(zhì)粒用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染293細(xì)胞的第4天開始可見零星的細(xì)胞上有GFP表達(dá)，隨著時間的延長，GFP表達(dá)的細(xì)胞量逐漸增多，第7天左右在熒光顯微鏡下見大量的細(xì)胞有綠色熒光發(fā)生（見圖5）。 參考資料：http://www.studa.net/yixue/081031/16370955-2.html

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  要幾度才能注冊 2009-04-21 00:00:00

  老大 老鼠沒有質(zhì)粒 質(zhì)粒是有遺傳效應(yīng)的環(huán)狀DNA 存在于大腸桿菌等細(xì)菌中

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  First星曦十月 2009-04-20 00:00:00

  小鼠有質(zhì)粒么?我記得好像沒有吧.

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  111清如 2009-04-21 00:00:00

  質(zhì)粒是真核細(xì)胞細(xì)胞核外或原核生物擬核區(qū)外能夠進(jìn)行自主復(fù)制的遺傳單位，包括真核生物的細(xì)胞器（主要指線粒體和葉綠體）中和細(xì)菌細(xì)胞擬核區(qū)以外的環(huán)狀脫氧核糖核酸(DNA)分子?，F(xiàn)在習(xí)慣上用來專指細(xì)菌(大腸桿菌）、酵母菌和放線菌等生物中細(xì)胞核或擬核中的DNA以外的DNA分子。 小鼠沒有葉綠體，你可以直接參照小鼠線粒體的提取方法進(jìn)行提取。

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