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  十幾年x 2016-05-04 00:00:00

  Z近我做了熒光定量PCR，每次做的時(shí)候溶解曲線效果就很差，不是單一的峰，說明是有非特異性的擴(kuò)增，但是在普通PCR儀上做的PCR時(shí)，只顯示了一條帶，很清晰，是怎么回事啊?熒光定量的靈敏度太大了么?還有斑馬魚的內(nèi)參基因怎么選取?做的是相對定量。答：你說對了，熒光定量的靈敏度太大了。你要明白件事情，EB染色的情況下，在電泳上要形成一個(gè)條帶的前提是存在5ng的DNA，也就是，如果你的非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物低于5ng的話，你在電泳上是觀察不到的，但是SYBRGreen染色的情況下，定量PCR可以檢測到。你具體PCR的條件我不是很清楚，但是你可以考慮通過以下幾個(gè)方面來優(yōu)化，一個(gè)是延長解鏈時(shí)間，保證DNA的充分解鏈，延長擴(kuò)增時(shí)間，保證擴(kuò)增的完整性，提高退火溫度，減少引物和模板的非特異性結(jié)合。此外，你的RNA在反轉(zhuǎn)錄前用DNase處理，減少基因組的污染，也有助于提高擴(kuò)增的特異性。你如果檢測相對表達(dá)，Z理想的狀態(tài)，干脆用特異性引物來反轉(zhuǎn)錄，事實(shí)上，雖然很多人做相對定量都習(xí)慣于用隨機(jī)引物或者是ologodT來反轉(zhuǎn)錄，但是從結(jié)果上講，使用特異引物做反轉(zhuǎn)錄Z后拿到的結(jié)果要更可靠，也更具有特異性。只是反轉(zhuǎn)錄的試劑消耗要加倍的，同一個(gè)樣品你必須單獨(dú)反轉(zhuǎn)錄內(nèi)參基因和目的基因。如果你要檢測其他目的基因，相應(yīng)消耗。至于內(nèi)參基因，一般動(dòng)物細(xì)胞的那幾個(gè)內(nèi)參基因，Acin，Tubulin，RPL32之類的，Z好你能預(yù)先檢測一下，挑一個(gè)Z穩(wěn)定的出來。不要隨便用，沒有全部通用的內(nèi)參基因的。………………詳細(xì)資料請參考：on

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