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  厄爾多思2 2017-03-19 00:00:00

  半定量pcr內(nèi)參基因擴(kuò)增條件和目的基因擴(kuò)增條件一樣 以參照物為標(biāo)準(zhǔn)，對PCR終產(chǎn)物進(jìn)行分析或?qū)CR過程進(jìn)行監(jiān)測，從而達(dá)到評估樣本 中靶基因的拷貝數(shù)，稱為定量PCR.根據(jù)反應(yīng)體系是否設(shè)有參照物以及是否與標(biāo)本在同一管中進(jìn)行擴(kuò)增，定量PCR可分為四種： ①有限稀釋法，即倍比稀釋法：通過稀釋陽性樣品直至靶基因不能再擴(kuò)增為止，來設(shè)置已知濃度的參照品；根據(jù)陽性結(jié)果的Z大稀釋度及內(nèi)參標(biāo)或外參標(biāo)的極限檢出底線，計算出待檢標(biāo)本中原始模 板的分子數(shù)；利用Z大稀釋度來進(jìn)行標(biāo)本核酸定量時的注意點.優(yōu)點是不需要特殊設(shè)備，缺點是擴(kuò)增反應(yīng)條件要標(biāo)準(zhǔn)化，嚴(yán)格注意污染，避免假陽性的產(chǎn)生. ②使用 外參照物的定量PCR，以已知濃度的目的基因為模板，按一定的倍比稀釋，然后做出標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，未知的標(biāo)本按這標(biāo)準(zhǔn)曲線找出對應(yīng)的拷貝數(shù).熒光定量PCR通 常使用該法做標(biāo)準(zhǔn)曲線. ③使用非競爭性內(nèi)參照物的定量：PCR反應(yīng)條件同樣，在同一試管內(nèi)，用兩對引物，同步擴(kuò)增來自同一DNA的一段靶序列和另一段內(nèi)標(biāo) 序列.通過比較兩種序列的擴(kuò)增產(chǎn)量可對靶序列定量.方法A、設(shè)計并合成PCR擴(kuò)增靶基因及無關(guān)基因的引物，優(yōu)化引物配比的條件.方法B、在指數(shù)增長期實現(xiàn) 對靶基因及一系列已知含量無關(guān)基因的PCR擴(kuò)增.方法C、PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳，EB 染色.方法D、電泳條帶的紫外光下分析.方法E、二者熒光強度相等管的DNA含量亦相等.該方法只有當(dāng)靶序列和內(nèi)標(biāo)序列以相同的量存在時，才能對兩者相對 定量；也是對處于擴(kuò)增指數(shù)期的PCR產(chǎn)物定量. ④使用競爭性內(nèi)參照物的定量PCR：同樣的反應(yīng)條件，同一個試管，用同一對引物，同步擴(kuò)增靶序列和內(nèi)參照序 列.靶基因的量可通基本條件是靶序列和競爭性序列均用相同的引物以相同的效率擴(kuò)增，兩序列的初始化比值在整個反應(yīng)過程中保持不變.目的DNA 內(nèi)參照DNA 變性（同一對引物）PCR競爭性模板的設(shè)置：通過改變克隆的靶基因的序列來設(shè)計競爭性模板插入新的限制性酶切位點或使原來的酶切位點缺失通過基因重組技術(shù) 插入一個與特異性蛋白結(jié)合的DNA片段，或者使靶序列發(fā)生定點誘變?nèi)斯ず铣筛偁幮阅０?競爭性模板設(shè)計目的：使其與靶基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物相區(qū)別（通過酶 切、雜交、顯色等手段實現(xiàn)）.常用的熒光定量為TaqMan探針技術(shù)，他特異的和目的片段結(jié)合，只是用的是TaqMan.半定量RT-PCR用做內(nèi)參照，也應(yīng)該是第三種，只是它是普通PCR，通過電泳的條帶強弱，與GAPDH的比值，分析他們的灰度值半定量，個人認(rèn)為數(shù)據(jù)不可靠，應(yīng)該用TaqMan做相對 定量或定量.用rt-pcr比較兩株細(xì)胞表達(dá)量的差異的時候，不一定要把兩株細(xì)胞調(diào)整為相同濃度，因為要做內(nèi)參照，可以校正模板量的差異

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