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  飯桶877 2018-04-01 18:07:28

  （以下方法僅供參考） 溶液配制 1 Tricine凝膠buffer 稱取SDS 0.3g，Tris 36.5g，用濃鹽酸調(diào)pH至8.45，定容至100mL。4℃保存，1個月內(nèi)使用。 2 5M HCL 濃鹽酸稀釋2.4倍，室溫保存，1個月內(nèi)使用。 3 49.5% Arc/Bis，3%C凝膠貯液 稱取48g丙烯酰胺，1.5g甲叉雙丙烯酰胺，蒸餾水溶解并定容至100mL。4℃保存，1個月內(nèi)使用。 4 50%甘油 取50mL甘油，加蒸餾水至100mL。室溫保存，1個月內(nèi)使用。 5 10％過硫酸銨溶液 稱取過硫酸銨10g，蒸餾水溶解并定容至100mL，分裝成1.2mL/支。-20℃保存，一年內(nèi)使用。 6 正極緩沖液 稱取 Tris 24g，用800mL蒸餾水溶解，1M HCL調(diào)pH至8.9，定容至1L。4℃保存，一個月內(nèi)使用。 7 負極緩沖液 稱取Tris 12.1g，Tricine 17.9g，SDS 1g，加水溶解，定容至1L。2-8℃保存，半個月內(nèi)使用。 8 非還原型樣品緩沖液（2×） 量取100mM Tris-cl 1mL、溴酚蘭20mg、十二烷基硫酸鈉0.4g、甘油2mL，加蒸餾水溶解并稀釋至10mL，冷凍保存，一年內(nèi)使用。 9 考馬斯亮蘭染色液 稱取考馬斯亮蘭R-250 0.25g，加入甲醇45mL、冰醋酸10mL、蒸餾水45mL，混勻即成，室溫保存，1個月內(nèi)使用。 10 脫色液 取甲醇450mL、冰醋酸100mL、注射用水450mL，混勻，室溫保存，3個月內(nèi)使用。 實驗流程 1 凝膠模具的組裝與檢漏 取1.0mm厚度的長短玻璃板，清洗干凈后組裝模具。注：短板朝里，若只跑一塊膠，電泳夾的對面也必須放置一塊電泳板。模具組裝完成后，沿長短玻璃板之間形成的空隙加入注射用水直至水加滿，平放模具。30S后，若液面不下降，則倒掉模具中的水，側(cè)立模具并用濾紙吸干長短玻璃板間的注射用水。若模具漏水，則重新組裝模具。 2Tricine SDS-PAGE 凝膠配制 （1）配制下層膠： 16.5%分離膠 10mL 注射用水 0.68mL Tricine 凝膠Buffer 3.4mL 49.5%Arc/Bis 3%C凝膠儲液 3.4mL 50%甘油 2.72mL TEMED 5μl 10%AP 100μl （2）配制上層膠： 5%濃縮膠Buffer 6mL 注射用水 3.6mL Tricine 凝膠Buffer 1.24mL 49.5%Arc/Bis 3%C凝膠儲液 0.4mL TEMED 6μl 10%AP 60μl 先配制下層膠，按下層膠配方依次加入相應(yīng)溶液后，立即混勻（尤其是加入TEMED和10%AP時動作要快），倒入準備好的凝膠模具中，注意勿打入氣泡，高度至槽高2/3-3/4。用移液器在凝膠上方輕輕加入蒸餾水，水封。20min凝膠聚合后，倒掉模具中水封用的蒸餾水，側(cè)立模具，用濾紙吸干模具中的水，但不要接觸到下層膠。再配制上層膠，向模具內(nèi)倒入上層膠至滿，插上1.0mm厚度的梳齒。20min凝膠聚合后，拆下模具托盤，將裝置放于電泳槽中，向玻璃板之間加入負極液至漫過短板，在外側(cè)盡量多地加入正極液，雙手均勻用力拔出梳齒。注：負極液必須漫過短板，正極液加入時不要和負極液相通。 2 電泳 將樣品與對照品用注射用水稀釋至1mg/mL，取30uL與2×非還原型上樣緩沖液30uL以1：1混合，煮沸2min，點樣量20μl/孔（雙復(fù)孔）。 分子量標準65℃預(yù)熱5min，點樣量10μl。恒流35mA，約2-3h結(jié)束。 3 染色和脫色 將電泳后的凝膠浸入裝有染色液的容器中，于搖床上低速震蕩染色約30min，然后更換為脫色液，于搖床上低速震蕩脫色至背景全無。 數(shù)據(jù)處理 用Quantity one 分析軟件分析電泳圖片，計算出電泳純度

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