參與評論

評論

登錄后參與評論

全部評論(1條)

• 

  lqqqianqi 2016-11-21 00:00:00

  植物DNA提取方法 方法一： 1.取兩片幼嫩新鮮葉片，置于預(yù)冷的研缽中，倒入適量液氮，迅速研磨成粉末狀，隨后加入3ml預(yù)熱的2%CTAB抽提緩沖液和50ul抗氧化劑2-巰基乙醇，繼續(xù)研磨成略有流動性的糊狀或粥狀，轉(zhuǎn)入1.5ml的離心管中，于65℃水浴鍋中保溫約60min。 2.待混合物冷卻至室溫后加入等600ul的CI（氯仿：異戊醇=24：1）溶液混勻，輕輕顛倒離心管幾次使管內(nèi)混合物成乳濁液，常溫下10000rpm離心10min，取上清液轉(zhuǎn)入另一干凈的離心管中。 3.重復(fù)步驟（2）一次。 4.取步驟（3）上清液加入2.5倍體積無水乙醇，仔細(xì)混勻，-20冰箱30min以上，沉淀DNA 4℃，12000rpm離心10min。 5.棄去上層有機(jī)溶劑，加500ul75%乙醇洗滌沉淀，4℃下8000rpm離心5min，棄去上清，洗滌沉淀3次。 6.倒置或者37度培養(yǎng)箱烘干。 7.加50ulTE緩沖液溶解DNA，于-20℃冷藏備用。 方法二： 1. 在50ml離心管中加入20ml提取緩沖液Ⅰ， 60℃水浴預(yù)熱。 2. 植物5-10g， 剪碎， 在研缽中加液氮磨成粉狀后立即倒入預(yù)熱的離心管中， 劇烈搖動混勻， 60℃水浴保溫30-60分鐘(時間長，DNA產(chǎn)量高)， 不時搖動。 3. 加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液， 顛倒混勻(需帶手套， 防止損傷皮膚)，室溫下靜置5-10分鐘， 使水相和有機(jī)相分層(必要時可重新混勻)。 4. 室溫下5000rpm離心5分鐘。 5. 仔細(xì)移取上清液至另一50ml離心管，加入1倍體積異丙醇，混勻，室溫下放置片刻即出現(xiàn)絮狀DNA沉淀。 6. 在1.5mleppendorf中加入1ml TE。用鉤狀玻璃棒撈出DNA絮團(tuán)，在干凈吸水紙上吸干，轉(zhuǎn)入含TE的離心管中，DNA很快溶解于TE。 7. 如DNA不形成絮狀沉淀，則可用5000rpm離心5分鐘， 再將沉淀移入TE管中。這樣收集的沉淀，往往難溶解于TE，可在60℃水浴放置15分鐘以上，以幫助溶解。 8. 將DNA溶液3000rpm離心5分鐘，上清液倒入干凈的5ml離心管。 9. 加入5μlRNaseA(10μg/μl)， 37℃ 10分鐘， 除去RNA(RNA對DNA的操作、分析一般無影響，可省略該步驟）。 10. 加入1/10體積的3mol/L NaAc及2×體積的冰乙醇，混勻，-20℃放置20分鐘左右，DNA形成絮狀沉淀。 11. 用玻棒撈出DNA沉淀，70%乙醇漂洗，再在干凈吸水紙上吸干。 12. 將DNA重溶解于1ml TE， -20貯存。 13. 取2μlDNA樣品在0.7% Agarose膠上電泳， 檢測DNA的分子大小。同時取15μl稀釋20倍， 測定OD260/OD280， 檢測DNA含量及質(zhì)量。 方法三： 植物DNA的SDS提取法： 試驗試劑： 1、研磨緩沖液：稱取59.63gNaCl，13.25g檸檬酸三鈉，37.2gEDTA－Na分別溶解后合并為一，用0.2mol/L的NaOH調(diào)至pH7.0，并定容至1000ml。 2、10×SSC溶液：稱取87.66gNaCl和44.12g檸檬酸三鈉，分別溶解，一起定容至1000ml。 3、1×SSC溶液：用10×SSC溶液稀釋10倍。 4、0.1×SSC溶液：用1×SSC溶液稀釋10倍。 5、Rnase溶液：用0.14mol/LNaCl溶液配制成25mg/ml的酶液，用1mol/LHCl，pH至5.0，使用前經(jīng)80℃水浴處理5min（以破壞可能存在的Dnase）。 6、氯仿－異戊醇：按24ml氯仿和1ml異戊醇混合。 7、5mol/L高氯酸鈉溶液：稱取NaClO4·H2O 70.23g，先加入少量蒸餾水溶解再容至100ml。 8、SDS（十二烷基硫酸鈉）化學(xué)試劑的重結(jié)晶：將SDS放入無水酒精中達(dá)到飽和為止，然后在70～80℃的水浴中溶解，趁熱過濾，冷卻之后即將濾液放入冰箱，待結(jié)晶出現(xiàn)再置室溫下涼干待用。 9、1mol/LHCl。 10、0.2mol/LNaOH。 11、二苯胺乙醛試劑：1.5g二苯胺溶于100ml冰醋酸中，添加1.5ml濃硫酸，裝入棕色瓶，貯存暗處，使用時加0.1ml乙醛液〔濃乙醛：H2O＝1：50（V／V）〕。 12、1.0mol/L高酸溶液（HClO4）。 13、0.05mol/LNaOH。 14、DNA標(biāo)準(zhǔn)液：取標(biāo)準(zhǔn)DNA25mg溶于少量0.05mol.L-1NaOH中，再用0.05mol/LNaOH定容至25ml，后用移溶管吸取此液5ml至50ml容量瓶中，加5.0ml1mol/LHClO4，混合冷卻后用0.5mol/LHClO4定容至刻度，則得100μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

  贊(7)

  回復(fù)(0)

  評論

  評論

  登錄后參與評論