親和力指得是抗體和靶點(diǎn)抗原的解離平衡常數(shù)，是一個(gè)非常重要的生物特性。在質(zhì)量控制過程中，常用ELISA方法進(jìn)行不同批次或者長期穩(wěn)定性樣品的親和力評(píng)價(jià)。親和力一般來說是絕對(duì)值，但是由于生物實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜性，材料批次的替換可能會(huì)影響到樣品的親和力檢測準(zhǔn)確性，常會(huì)引入一個(gè)默認(rèn)質(zhì)量屬性不會(huì)變化的對(duì)照品作為參比品，待測樣品和參比品一同進(jìn)行檢測來抵消材料造成的偏差，并計(jì)算待測樣品相對(duì)于參比品的親和力（相對(duì)結(jié)合活性）?？贵wEC50是指半有效濃度，用于衡量抗體的親和力。在抗體的功能研究中，EC50值表示在特定實(shí)驗(yàn)條件下，抗體達(dá)到其效果所需要的濃度。較低的EC50更好，表示抗體對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的親和力更高。

一．飽和濃度法計(jì)算EC50值

采用飽和濃度法（R代表受體或抗原，L代表配體或抗體），如果要測定配體相對(duì)于受體的親和力，少量R存在的情況下，將L進(jìn)行梯度稀釋，檢測R-L復(fù)合物的濃度，當(dāng)R-L復(fù)合物的濃度占總R濃度的一半時(shí)，L對(duì)應(yīng)的濃度值（EC50）即L相對(duì)于R的KD值。RL復(fù)合物/R即B值可用檢測的信號(hào)值代替，梯度稀釋的L和信號(hào)之間的函數(shù)關(guān)系滿足下面的公式，只有在此在特定的實(shí)驗(yàn)條件下EC50值能夠等價(jià)于KD值。

飽和濃度法測定KD值有幾個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，即相互作用的兩個(gè)分子，R要少量，L要進(jìn)行連續(xù)的梯度稀釋，需要得到Z大的信號(hào)響應(yīng)值（所有的R的結(jié)合位點(diǎn)被L占據(jù)）即平臺(tái)期，那么在此條件下，占據(jù)一半R時(shí)，所需要的L濃度（EC50）為KD值。計(jì)算等式如下：

圖1 計(jì)算等式

二．抗體EC50測定步驟

1. 選擇合適的抗原：根據(jù)研究目的選擇與抗體結(jié)合的特定抗原。

2. 選擇合適的實(shí)驗(yàn)體系：可以選擇細(xì)胞表面表達(dá)抗原或合成的抗原等。

3. 制備抗原溶液：按照一定濃度序列制備一系列抗原溶液。

4. 操作平臺(tái)設(shè)置：使用專業(yè)的生物技術(shù)設(shè)備和軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)置。

5. 抗體與抗原結(jié)合：將抗體與抗原溶液進(jìn)行反應(yīng)，一定時(shí)間后使其達(dá)到平衡狀態(tài)。

6. 反應(yīng)終止與分離：通過適當(dāng)?shù)姆椒ńK止反應(yīng)，并將未結(jié)合的抗體與抗原分離。

7. 信號(hào)檢測：使用合適的檢測方法，如酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）等，測定已結(jié)合的抗體數(shù)量。

8. 數(shù)據(jù)分析：根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制曲線并計(jì)算出EC50。

三．抗體親和力檢測注意事項(xiàng)

1. 標(biāo)準(zhǔn)的劑量曲線擬合一般用四參數(shù)擬合，需要有明顯的上下平臺(tái)期（A，D值），斜率一般在0.8-1.2（B值）之間，EC50（C值）即為抗體相對(duì)于抗原的親和力值。

2. 酶聯(lián)抗體效應(yīng)過量，酶聯(lián)抗體的稀釋需要做不同的稀釋度進(jìn)行比較選擇，對(duì)于單抗成分的酶聯(lián)抗體，如果高低兩個(gè)稀釋度的酶聯(lián)抗體能夠產(chǎn)生一樣的劑量曲線，說明酶聯(lián)抗體過量，ELISA的信號(hào)傳遞未產(chǎn)生偏差。對(duì)于多抗成分的酶聯(lián)抗體，其稀釋度的判斷較為復(fù)雜，可以初略計(jì)算下酶聯(lián)抗體的摩爾濃度要高于包被上的抗原摩爾濃度的5倍以上。當(dāng)酶聯(lián)抗體濃度較小時(shí)，酶聯(lián)抗體在高劑量不同濃度的抗體條件下均被抓到，曲線有假上平臺(tái)。

3. 如果需要減少反應(yīng)過程中高濃度的抗體（100000ng/ml）對(duì)酶標(biāo)板材的非特異吸附，在包被過程中，建議選擇疏水性酶標(biāo)板材（polysorp），包被的抗原濃度需要少量0.2-1ug/ml，具體情況需要根據(jù)抗原抗體的親和力大小來進(jìn)行判斷優(yōu)化。一般來說親和力越強(qiáng)，所需的抗原包被濃度越低。

4. 對(duì)于吸光度值底物和熒光底物，儀器檢測的信號(hào)值和顯色時(shí)間成正比，控制在10-30分鐘為宜。需要提前確認(rèn)檢測儀器的信號(hào)線性范圍，比如一般的酶標(biāo)儀吸光度值的信號(hào)線性范圍在0-3，吸光度值在3-4之間為非線性的，在顯色時(shí)應(yīng)控制信號(hào)值不要超過3，當(dāng)信號(hào)值超過線性范圍時(shí)，曲線有假上平臺(tái)。

泰克生物致力于親和力檢測研究，能夠給客戶提供專業(yè)、有效的售前技術(shù)咨詢和準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)支撐，為客戶的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目提供強(qiáng)有力的保障。目前，常用的檢測親和力的方法有很多，但其中大多數(shù)要么依賴昂貴的設(shè)備（表面等離子體共振），要么不普遍適用（熒光修飾、透析）或者需要修飾的抗原（放射性沉淀標(biāo)記的抗原）。而競爭ELISA法測定親和力則是例外，它僅依賴于少量純化抗原和抗體即可進(jìn)行親和力的檢測。