烏頭雙酯型生物堿 (烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿等，劇毒) 經(jīng)炮制 (浸泡、蒸煮、砂燙等) 后，C-8 位乙酰基水解生成烏頭單酯型生物堿 (如苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿等，低毒)，而 C-14 位苯甲酰基進(jìn)一步水解生成烏頭醇胺型生物堿 (如烏頭原堿、新烏頭原堿、次烏頭原堿等，微毒) ^[4]，如圖 1 所示。

川烏 (制川烏)、草烏 (制草烏) 和附子中所含的烏頭雙酯型生物堿主要為烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿等，而黃草烏 (制黃草烏) 中所含的烏頭雙酯型生物堿主要為滇烏頭堿、草烏甲素等^[5]。目前市售的烏頭雙酯型生物堿對(duì)照提取物含量以新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿三種計(jì)，且部分中成藥品種中烏頭雙酯型生物堿的測(cè)定，受樣品基質(zhì)干擾較為嚴(yán)重。賽默飛實(shí)驗(yàn)室建立一種涵蓋 5 種烏頭雙酯型生物堿和 3 烏頭單酯型生物堿的測(cè)定全新方法，以便于制藥企業(yè)更全面地控制相關(guān)制劑的質(zhì)量。

對(duì)照品溶液及供試品溶液的制備

8 種烏頭堿對(duì)照品溶液均購(gòu)自標(biāo)準(zhǔn)品供應(yīng)商，2 批次江油生附片供試品溶液均由客戶(hù)提供。

對(duì)照品溶液的制備：取苯甲酰新烏頭原堿對(duì)照品、苯甲酰烏頭原堿對(duì)照品、苯甲酰次烏頭原堿對(duì)照品、新烏頭堿對(duì)照品、烏頭堿對(duì)照品、次烏頭堿對(duì)照品、滇烏頭堿對(duì)照品、粗莖烏頭堿甲 (草烏甲素) 對(duì)照品溶液適量，精密稱(chēng)定，加乙腈制成每 1 mL 各含 10 μg 的混合溶液，即得。

供試品溶液的制備：取本品粉末約 1.0 g，精密稱(chēng)定，置于 25 mL 具塞玻璃試管中，準(zhǔn)確加入異丙醇-乙酸乙酯 (1:1) 混合溶液 10 mL（含氨試液 0.6 mL），密塞，冰水浴超聲提取 30 min，室溫靜置沉降。移取 5 mL 上清液至 15 mL 離心管中，8000 rpm 20 ℃ 離心 5 min，準(zhǔn)確取 4.00 mL 至潔凈氮吹管中 30 ℃ 水浴氮吹至近干，準(zhǔn)確加入 2.00 mL 乙腈復(fù)溶（渦旋/超聲/渦旋）， 5000 rpm 20 ℃ 離心 3 min，復(fù)溶液過(guò) 0.2 μm 親水性 PTFE 濾膜 (P/N: 42213-NPL)，濾液待上機(jī)測(cè)試。

測(cè)定法：分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各 5 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。

儀器配置及色譜條件

Thermo Scientific? Vanquish Core? 高效液相色譜系統(tǒng)，配置：泵 Quaternary Pump C (VC-P20-A)，自動(dòng)進(jìn)樣器 Split Sampler CT (VC-A12-A)，柱溫箱 Column Compartment C (VC-C10-A)，檢測(cè)器 Diode Array Detector CG (VC-D11-A)，數(shù)據(jù)處理 Chromeleon? 7.3

色譜柱：Acclaim Mixed-Mode WCX-1, 3 μm, 3.0×150 mm    (P/N: 070092)

流動(dòng)相：A: 超純水 B: 100 mM (NH₄)H₂PO₄ (磷酸調(diào)節(jié) pH 至 3.0) C: 乙腈

流速：0.5 mL/min

梯度洗脫程序：詳見(jiàn)附件應(yīng)用解決方案

進(jìn)樣量：5 μL

柱溫：40 ℃

檢測(cè)器：DAD, 采集波長(zhǎng): 230 / 260 nm；采集頻率: 5 Hz；光譜采集: 190-400 nm

譜圖及數(shù)據(jù)

圖 2 8 種烏頭堿混合對(duì)照品溶液分離譜圖及數(shù)據(jù)  (10.0 μg/mL)（點(diǎn)擊查看大圖）

圖 3 8 種烏頭堿單一對(duì)照品溶液定位譜圖 (10.0 μg/mL)（點(diǎn)擊查看大圖）

圖 4 生附片供試品溶液分離譜圖及數(shù)據(jù) (S1)

（點(diǎn)擊查看大圖）

圖 5 生附片供試品溶液分離譜圖及數(shù)據(jù) (S2)

（點(diǎn)擊查看大圖）

結(jié)果與討論