引言

在細(xì)胞外囊泡（EVs）下游工藝的顆粒定量監(jiān)測方面，行業(yè)長期面臨諸多挑戰(zhàn)。這些挑戰(zhàn)往往源于剪切力對顆粒穩(wěn)定性的破壞、配方工藝尚未優(yōu)化，以及復(fù)雜培養(yǎng)基中聚集體的干擾。

本文采用Phoenestra的無血清、無 hPL 的培養(yǎng)體系，結(jié)合溫和的純化工藝，有效規(guī)避了這些干擾因素，可以實(shí)現(xiàn) EV 顆粒質(zhì)量的精準(zhǔn)平衡評估，并計算來源于間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞（MSC）的 EV 工藝產(chǎn)率；然后再借助Particle Metrix的納米顆粒跟蹤分析儀ZetaView與 F-NTA 四跨膜蛋白檢測試劑盒，可以成功實(shí)現(xiàn)在下游工藝過程中對四跨膜蛋白陽性顆粒的靈敏檢測與動態(tài)追蹤。

這一技術(shù)組合不僅提升了EV檢測的準(zhǔn)確性和特異性，更顯著提高了整個生產(chǎn)流程的可控性與標(biāo)準(zhǔn)化水平。

實(shí)驗(yàn)方法

MSC/TERT 細(xì)胞培養(yǎng)的上清液通過 EVscale? 技術(shù)以灌流模式持續(xù)收集。收集到的溶液保存在 -80°C 條件下。

第一步：處理時，先進(jìn)行一次溫和的深層過濾（截留孔徑為 2–4 μm）。為提高回收率，再使用緩沖液對濾膜進(jìn)行沖洗，最終獲得濃縮倍數(shù)（CF）為 0.8 的產(chǎn)物。

第二步：借用低剪切力的膜泵和截留分子量為 300 kDa 的中空纖維膜組件，進(jìn)行切向流過濾（TFF）純化。在此步驟中，樣品溶液被濃縮，并通過六個透析體積的緩沖液進(jìn)行溶液替換。最終，緩沖液更換率達(dá)到 98%以上，濃縮倍數(shù)為 3–4。

第三步：為進(jìn)一步提高顆粒濃度，再對樣品進(jìn)行超濾離心處理（截留分子量100 kDa），超濾后的濃縮倍數(shù)約為 50。

第四步：再通過離心的方法去除純化過程中形成的聚集體和沉淀物，把樣品等量分裝。

在以上每一個純化步驟前、后均采集樣品，并通過納米顆粒跟蹤分析儀ZetaView（Particle Metrix）進(jìn)行檢測。其中，散射光模式（NTA）用于測定總顆粒數(shù)，而結(jié)合了四跨膜蛋白檢測試劑盒的熒光模式（F-NTA），用于定量測定表達(dá)了CD9、CD63 和 CD81 的細(xì)胞外囊泡。

圖3：四跨膜蛋白陽性顆粒（F-NTA）在總顆粒（NTA）中的比例：展示了在下游純化工藝過程中，四跨膜蛋白陽性顆粒（即 EV）在總顆粒中的占比逐步上升的過程，這也說明了非 EV 顆粒在該純化工藝中已被有效去除。

總結(jié)

? 在本文中，使用無血清和無 hPL 的培養(yǎng)基，結(jié)合溫和的純化工藝，納米顆粒跟蹤分析儀ZetaView（NTA）可作為可靠的顆粒質(zhì)量平衡分析工具。

? 借助四跨膜蛋白檢測試劑盒進(jìn)行NTA技術(shù)的熒光標(biāo)記檢測（F-NTA），可以有效驗(yàn)證 EV 富集方法的特異性，確保所獲得的顆粒確實(shí)為EV顆粒。

參考文獻(xiàn)：

Melanie Reininger*, Claudia Lindner*, Dr. Ingrid Hartl*, Dr. Christina Klasen**,

Dr. Roland Prielhofer* and Dr. Klaus Graumann*

*Phoenestra GmbH

**Particle Metrix GmbH