對清醒自由活動動物神經(jīng)系統(tǒng)的研究，是當代神經(jīng)科學(xué)研究中一個至關(guān)重要的問題。通過檢測神經(jīng)元活動相關(guān)的鈣信號，我們能夠更好地理解復(fù)雜的神經(jīng)回路。

       近年來，包括雙光子顯微鏡，微型顯微鏡和光纖記錄法在內(nèi)的技術(shù)發(fā)展，我們能夠?qū)游锏拟}信號變化進行實時檢測。利用遺傳編碼的鈣指示劑可以實現(xiàn)在體細胞內(nèi)鈣活動的可視化。研究人員可使用工程化的熒光蛋白，標記特定細胞類型的神經(jīng)元，通過記錄熒光信號的變化來反映細胞內(nèi)鈣離子濃度的變化，進而表征神經(jīng)元的活動。

       接下來我們就一起來看看這三種體內(nèi)鈣信號記錄方法的優(yōu)缺點。

A雙光子鈣成像、B微型顯微鏡（單光子鈣成像）、C光纖記錄法

雙光子鈣成像

       在過去，大多數(shù)的體內(nèi)鈣成像是在雙光子顯微鏡下完成的。雙光子顯微鏡是一種熒光成像技術(shù)，其中兩束相干激光通過顯微鏡的目鏡聚焦到一個由點擴散函數(shù)定義的點上，類似于共聚焦顯微鏡選擇性地激發(fā)類熒光分子。雙光子顯微鏡和共聚焦顯微鏡的主要區(qū)別在于光吸收和熒光發(fā)射的物理過程。

優(yōu)勢

       在雙光子顯微鏡中，激發(fā)光波長在700-1000nm附近，接近紅外光譜。這是體內(nèi)雙光子成像的**個優(yōu)勢：長波長的光在組織中的散射更少，穿透深度更大。

       其次是具有良好的分辨率，不僅允許單個神經(jīng)元可視化，而且可以看到亞細胞結(jié)構(gòu)軸突末端的鈣活動。

劣勢

       雙光子顯微鏡中的激光掃描技術(shù)也用于檢測體內(nèi)成像時神經(jīng)元的快速鈣動力學(xué)。使用激光掃描時必須考慮到不同采樣率可能發(fā)生的光漂白的強度，區(qū)分信號和噪聲的激發(fā)光強度通常需要足夠高，會引起一定程度的漂白，光漂白超時會對圖像質(zhì)量產(chǎn)生負面影響。

       雙光子顯微鏡在成像深度方面受許多因素制約。可以植入微型內(nèi)窺鏡（梯度折射率（GRIN）的透鏡）使更深部的腦區(qū)可視化，但是由于物鏡的大小，大部分皮層或其他腦區(qū)結(jié)構(gòu)經(jīng)常需要被完全移除來為透鏡植入留出空間，這樣可能會嚴重影響動物的行為。因此，當使用雙光子顯微鏡進行成像時，選擇大腦表面層作為研究區(qū)域是非常有利的，因為損傷Z小，分辨率更高。

       雙光子顯微鏡體內(nèi)鈣成像的另一個缺點是由于物鏡的大小，動物必須被頭部固定。目前實驗者通過使用圓柱形或球形跑步機使得動物能夠稍微自由移動，或者通過一個虛擬現(xiàn)實場景進一步實現(xiàn)動物自由移動。然而，這種虛擬現(xiàn)實加頭部固定成像的方法，已經(jīng)遭到許多科學(xué)家的質(zhì)疑。人們認為，頭部固定的動物在實驗期間一直處在物理約束和情緒壓力下，因此無法證明神經(jīng)元對外界的響應(yīng)在虛擬現(xiàn)實和自由探索下是等價的。更重要的是，許多社會行為，比如親子護理，交配和戰(zhàn)斗，都不能用頭部固定的實驗來研究。

微型顯微鏡

優(yōu)勢

       基于微型顯微鏡的單光子活體鈣成像，研究人員可以記錄自由活動動物的鈣信號。該微型顯微鏡通過與梯度折射率（GRIN）的透鏡連接，可完成長時間內(nèi)群體神經(jīng)元活動的觀察。這種、裝置體積小，可以固定在動物頭上，不會嚴重阻礙其運動。這項技術(shù)的發(fā)展使得微型顯微鏡成為研究發(fā)育、神經(jīng)可塑性和神經(jīng)退化性疾病的一種非常有用的工具。

劣勢

       盡管使用微型顯微鏡在自由活動的動物中進行鈣成像有很強的實用性，但這種方法仍存在一定局限性。與雙光子相比，單光子成像背景熒光更高，并且更容易發(fā)生光散射。并且在某些行為學(xué)實驗在應(yīng)用受限，比如水迷宮和強迫游泳實驗。此外，由于GRIN透鏡植入物的直徑范圍為0.5mm~1mm，不可避免地會造成一定范圍的組織損傷，這可能會影響研究的關(guān)鍵回路。

光纖記錄法

優(yōu)勢

       光纖記錄系統(tǒng)原理上主要分為熒光激發(fā)系統(tǒng)和收集系統(tǒng)，即向?qū)嶒瀯游锎竽X特定腦區(qū)注射一定量的鈣染料或遺傳編碼的鈣指示劑，并在相同位置植入一根直徑200-400μm的光纖，這根光纖既用于傳送激發(fā)光，同時又可以收集發(fā)射光，收集到的熒光經(jīng)PMT或CMOS傳感器轉(zhuǎn)換為電信號，隨后經(jīng)數(shù)據(jù)采集卡被傳送至記錄系統(tǒng)，以達到實時觀察所研究腦區(qū)一群神經(jīng)細胞鈣熒光活動的目的。并且由于光纖探頭的體積小和質(zhì)量輕，研究人員可以同時對多個大腦區(qū)域進行記錄。

       2014年，斯坦福大學(xué)的Karl Deisseroth教授實驗室在發(fā)表的文章中S次命名了光纖記錄（Fiber Photometry）技術(shù)，這種方法S次實現(xiàn)了動物行為與神經(jīng)元軸突末梢鈣活動的同時追蹤，結(jié)合光遺傳技術(shù)，闡明了腹側(cè)背蓋區(qū)-伏隔核的神經(jīng)投射在編碼和預(yù)測社交行為中的作用?；谶z傳編碼鈣指示劑的發(fā)展，實驗人員可以實現(xiàn)細胞類型特異性的標記，監(jiān)測小鼠在完成復(fù)雜行為任務(wù)過程中一群特定類型細胞的平均活動。這種技術(shù)的出現(xiàn)對于編碼社交行為、學(xué)習記憶和恐懼等行為以及病理狀態(tài)下的回路水平神經(jīng)信號的探測具有里程碑式的意義。

總結(jié)

       雙光子鈣成像具有較高的分辨率，單光子鈣成像具有一定的機動性，但兩種方法都存在一定的局限性。雙光子需要動物頭部固定，并且只能成像大腦表層軸突末端的鈣活動。微型顯微鏡雖然能成像細胞體，但需要植入直徑為0.5 - 1mm的GRIN透鏡，這必然會造成組織損傷。而光纖記錄法的局限是無法監(jiān)測單個細胞的活動，只能檢測光纖探針附近的群體神經(jīng)元鈣信號。

       盡管如此，研究人員通過雙光子鈣成像、單光子微型顯微鏡和光纖記錄法，可以從不同空間尺度上觀察細胞鈣信號的變化，揭示鈣活動在神經(jīng)科學(xué)研究中的重要意義。

參考文獻：Kasey S Girven, Dennis Ryan Sparta. Probing deep brain circuitry: New advances in in vivo calcium measurement strategies[J]. ACS Chem Neurosci. 2017 Feb 15;8(2):243-251.

Gunaydin LA, Grosenick L, Finkelstein JC, et al. Natural neural projection dynamics underlying social behavior[J]. Cell, 2014, 157(7): 1535-51.

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