大多數(shù)小分子藥物和生物藥(包括單克隆抗體)可以作用于治療靶點，從而改變其功能。藥物開發(fā)的前提是通過對這些靶點的鑒別，通常是蛋白質(zhì)或核酸，明確它們在疾病中所起到的因果作用以及具有一定的“成藥性”，例如藥物有適當(dāng)?shù)乃幚碜饔?。藥物開發(fā)過程往往是耗時長，風(fēng)險高且花費巨大。一種新藥從發(fā)現(xiàn)到被批準(zhǔn)上市，盡管精確的時間表各不相同，但通常需要10年以上的時間2。此外，在每年開發(fā)的許多候選藥物中，只有很少一部分能夠獲得監(jiān)管機構(gòu)的批準(zhǔn)進入臨床試驗研究。篩選靶點特異性結(jié)合的候選藥物，驗證與靶點的相互作用，需要多種工藝和表征技術(shù)，而這些工藝和表征技術(shù)的局限性又是藥物研發(fā)耗時冗長的諸多原因之一。具備實時分析和高通量性能的現(xiàn)代分析技術(shù)大大縮短了藥物研發(fā)時間，并運用簡化的方式選擇最佳候選藥物，為下游開發(fā)的成功提供了最佳機會。

傳統(tǒng)的分析技術(shù)，例如基于熒光的方法，都需要對分析物或二抗分子標(biāo)記上熒光信號。標(biāo)記位點通常不具備特異性，因此可能會導(dǎo)致結(jié)構(gòu)改變，從而影響其活性。需要標(biāo)記的分析方法往往包含多個特定的步驟，每個步驟都需要進行優(yōu)化，最終導(dǎo)致研發(fā)時間的增加。此外，由于熒光標(biāo)記的干擾而產(chǎn)生的假陽性結(jié)果可能對數(shù)據(jù)質(zhì)量產(chǎn)生不利影響。近20年來，非標(biāo)記分析技術(shù)在藥物早期發(fā)現(xiàn)中展現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢。由于不需要標(biāo)記試劑，非標(biāo)記分析平臺能夠大幅加快實驗開發(fā)過程。非標(biāo)記技術(shù)在藥物發(fā)現(xiàn)中的關(guān)鍵應(yīng)用包括通過平衡解離常數(shù)(KD)，結(jié)合速率常數(shù)(ka)，解離速率常數(shù)(kd)等動力學(xué)參數(shù)，評估結(jié)合藥物與靶點的結(jié)合活性。圖1展示了藥物早期發(fā)現(xiàn)階段常規(guī)工作流程中的關(guān)鍵步驟。

測定平衡親和常數(shù)和動力學(xué)速率常數(shù)，是識別目標(biāo)分子、選擇和優(yōu)化先導(dǎo)藥物的關(guān)鍵過程。這些參數(shù)使研究人員能夠更好地了解候選藥物對其靶點的潛在作用機制（MOA），并為選擇最佳候選治療藥物提供信息，從而推進整個開發(fā)周期。除了新先導(dǎo)藥物分子外，在將生物類似藥物分子與其對應(yīng)的原研藥物進行比較時，動力學(xué)特征也非常關(guān)鍵。對于生物類似藥而言，其產(chǎn)品質(zhì)量屬性的評估至關(guān)重要，尤其是通過研究配體結(jié)合的功能等效性評估，為患者在類似臨床安全性和有效性方面提供重要信心。一般來說，通常使用純化的樣品對先導(dǎo)藥物分子進行全面的表征，然而，在篩選實驗中的解離速率排序和先導(dǎo)藥物分子的選擇時，可以使用未純化的樣品進行。對于開發(fā)抗體類藥物，在分類和選擇最佳抗體克隆時，也需要進行表位分組等其他表征實驗。

在表征功能性質(zhì)時，生物分子間相互作用的動力學(xué)分析尤其重要，是研發(fā)和生產(chǎn)過程中必不可缺的分析步驟。人們傳統(tǒng)上使用像ELISA這樣的終點法來描述結(jié)合相互作用。然而，ELISA有許多缺點，包括不能解析結(jié)合和解離動力學(xué)特性。例如，相同的穩(wěn)態(tài)結(jié)合親和力可能源于截然不同的動力學(xué)，科學(xué)家在選擇先導(dǎo)藥物的過程中可以依據(jù)這些信息做出決策（圖2）。此外，由于ELISA實驗方案中包含許多清洗步驟，弱相互作用可能難以被監(jiān)測到。另一方面，高通量非標(biāo)記技術(shù)為動力學(xué)測量提供了獨特的見解。這些技術(shù)提供了動力學(xué)細(xì)節(jié)，例如結(jié)合（ka）和解離（kd）速率，該速率信息可為相互作用機制提供更多的信息。此外還有親和力常數(shù)（KD），該常數(shù)可以衡量配體與其分析物之間結(jié)合的緊密程度。這是指標(biāo)可以很好的在開發(fā)過程中指導(dǎo)藥物療效所需的濃度。

雖然在藥物研發(fā)中仍然會使用諸如ELISA和Western Blots等傳統(tǒng)生化分析方法，但是越來越多的科學(xué)家在他們的工作流程中開始采用非標(biāo)記分析技術(shù)?；谶@些技術(shù)的系統(tǒng)可以將生物分子間的相互作用轉(zhuǎn)化為響應(yīng)信號（通常是實時信號），為研究人員提供研究表征結(jié)合機制的工具。除此之外，這些系統(tǒng)可用于動力學(xué)表征、濃度測定和生物分子相互作用篩選等。非標(biāo)記技術(shù)可在動力學(xué)表征實驗中提供結(jié)合/解離速率信息，這是和親和力常數(shù)息息相關(guān)的重要因素，也是終點法分析技術(shù)（如ELISA）所無法提供的。常用的非標(biāo)記技術(shù)有：等溫滴定量熱技術(shù)（ITC）、表面等離子共振技術(shù)（SPR）和生物層干涉技術(shù)（BLI），每種技術(shù)都有其獨特的優(yōu)點。面對如此多的選擇，研究人員應(yīng)用所需的技術(shù)，在藥物研發(fā)過程的各個階段推動候選藥物快速準(zhǔn)確地進行。在這些常用的非標(biāo)記技術(shù)中，ITC所提供的豐富的熱力學(xué)數(shù)據(jù)具有廣泛的用途；但在相互作用研究中，ITC無法提供動力學(xué)信息，如ka和kd值。SPR和BLI雖然無法獲取豐富的熱力學(xué)數(shù)據(jù)，但它們都可提供帶有豐富信息的親和力表征數(shù)據(jù)，例如ka和kd值（請在此處閱讀有關(guān)非標(biāo)記技術(shù)的更多信息）?；贐LI技術(shù)的Octet^?平臺具有獨特的優(yōu)勢，使其成為加速藥物早期發(fā)現(xiàn)的理想技術(shù)。

Octet^?平臺采用96孔或384孔樣品板，儀器的讀取探頭可直接移動到樣品板中。與SPR技術(shù)明顯不同的是， Octet采用非流路設(shè)計，可以更好的耐受不同樣品的基質(zhì)。與SPR儀器相比，Octet^?系統(tǒng)也相對易于使用，其對使用者的操作和分析技能要求相對更低，并且不需要在樣品裝載或樣品運行時的清洗環(huán)節(jié)上浪費大量時間。這些特性，加上其一次可同時分析多達(dá)96個樣品（Octet^?  RH96）的能力，使得Octet^?成為藥物早期發(fā)現(xiàn)階段中理想的先導(dǎo)藥物選擇系統(tǒng)。

Octet^?系統(tǒng)用于藥物早期發(fā)現(xiàn)的優(yōu)勢：

-無流路；不堵塞樣品，系統(tǒng)可兼容多種類型的粗樣品

-易于使用，用途廣泛；與其他技術(shù)相比，使用者的技能門檻較低

-高通量；能夠快速篩選主要生物制藥的靶點

-低維護；與SPR技術(shù)相比，維護時間大幅減少

新治療藥物的發(fā)現(xiàn)始于靶標(biāo)識別；即識別與疾病病理生理學(xué)相關(guān)的生物學(xué)靶點的過程4。非標(biāo)記實驗可以監(jiān)測不同類型的生物分子之間的相互作用，包括蛋白質(zhì)、DNA/RNA、抗體、病毒和細(xì)胞。現(xiàn)有豐富的人類遺傳信息可用于識別藥物靶點、驗證治療方案并預(yù)測針對分子靶點的抑制性化合物的潛在安全性。一旦確定了靶點，下一步就是開發(fā)一個分子庫來篩選有希望的先導(dǎo)候選藥物。這個過程通常包括篩選數(shù)以萬計的小分子或生物藥，用以確定可與細(xì)胞疾病的靶點蛋白相結(jié)合并引起變化的少數(shù)最佳候選藥物（通常3-5個）。

在藥物發(fā)現(xiàn)項目中，基于片段的藥物發(fā)現(xiàn)（FBDD）是一個用于識別小分子候選藥物的熱門平臺。片段結(jié)合可以使用靈敏的生物物理技術(shù)來檢測和表征，該技術(shù)能夠檢測小分子化合物的弱親和力相互作用。諸如核磁共振（NMR）、X射線晶體衍射、差示掃描熒光法（DSF）、SPR和BLI等技術(shù)是許多制藥和生物技術(shù)實驗室用于識別目標(biāo)靶點的核心技術(shù)。然而，片段篩選往往受到樣品量大、分子量低（<300 Da）、親和力弱（KD=10 μM-10 mM）和溶解度低等諸多限制。微弱的親和力和有限的溶解度就需要使用高于相互作用KD值的樣品濃度來測試結(jié)合，但這個條件往往又不切實際，并且經(jīng)常導(dǎo)致最終做出決策是基于不適當(dāng)?shù)膶嶒炘O(shè)置條件。Pioneer FE是新一代的SPR儀器，可憑借其獨有的一步進樣（OneStep）功能做出更好的決策5。OneStep進樣功能可通過在進樣管道中生成樣品或分析物的梯度濃度來增加樣品通量和數(shù)據(jù)信息量，從而顯著改善基于SPR技術(shù)的片段篩選。Pioneer FE旨在通過在單次樣品進樣中測試全濃度梯度來簡化結(jié)合分析。這不僅節(jié)省了樣品制備時間和材料，而且免除了制備多濃度樣品稀釋液的需求，也減少人為誤差。OneStep進樣功能還通過簡化工作流程的效率，顯著改善SPR生物傳感器芯片檢測的運作方式（在此處了解更多信息）。當(dāng)候選片段選擇在初步篩選過程中就完成優(yōu)化，則完全沒有必要再進行二次篩選（圖3和圖4）。

在選擇具有最佳藥物特性的候選藥物時，通常要對靶向特異性、可生產(chǎn)性和可開發(fā)性等指標(biāo)對生物制藥候選庫（如雜交瘤或噬菌體展示）開展篩選。篩選工作通常從分析主要目標(biāo)靶點的結(jié)合開始，然后再進行動力學(xué)表征。必須在發(fā)現(xiàn)過程的早期就把那些靶點結(jié)合親和力較弱、靶點選擇性低、生化或生物物理特性差的不良苗頭藥物都剔除掉。然而，如果需要在分析前對大量的雜交瘤或噬菌體展示樣品進行純化，那么先導(dǎo)藥物的選擇和優(yōu)化就會成為一個瓶頸問題。由于非特異性結(jié)合高和檢測分辨率低，大多數(shù)分析技術(shù)無法在粗樣品中實現(xiàn)準(zhǔn)確的測量。由于粗樣品通常會導(dǎo)致微流路管道的堵塞，因此與使用微流路設(shè)計的系統(tǒng)相比，應(yīng)用非標(biāo)記技術(shù)（如Octet^?) 的系統(tǒng)是分析這些類型樣品的理想選擇。

生物制藥通常都是大分子，需要具有高通量能力的技術(shù)來同時快速篩選多個樣品。更關(guān)鍵的是能夠在其原液中直接篩選出這些分子，從而節(jié)省純化樣品所需的時間和資源。

雜交瘤是由抗原免疫小鼠的脾 臟B細(xì)胞和骨 髓瘤細(xì)胞系融合而成。雜交瘤是產(chǎn)生抗體的克隆細(xì)胞系，可被用于抗原特異性結(jié)合的篩選。迄今為止，有一半以上的商業(yè)化抗體藥物來自雜交瘤細(xì)胞系，并且雜交瘤已被用于生產(chǎn)雙特異性單克隆抗體。在開發(fā)單克隆抗體療法時，篩選融合雜交瘤以及亞克隆候選雜交瘤，是一個非常耗時的步驟。這一挑戰(zhàn)不僅體現(xiàn)于先導(dǎo)藥物在基于體內(nèi)療效和表位作圖的選擇，也體現(xiàn)于先導(dǎo)藥物優(yōu)化過程中的人源化、親和力成熟、藥物安全性研究和生物標(biāo)記物開發(fā)等方面。傳統(tǒng)上，在將雜交瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移到多孔分析板之前，需要使用細(xì)胞分選法將雜交瘤分離成單個細(xì)胞，然后使用單點結(jié)合實驗篩選雜交瘤上清液，用以評估抗原結(jié)合。之后可以分離一部分陽性克隆用以抗體鑒別，這些抗體將被表達(dá)和純化，以作進一步的表征。因此，篩選雜交瘤上清液用于抗原結(jié)合抗體是發(fā)現(xiàn)過程中的關(guān)鍵步驟。高通量技術(shù)可以大幅縮短選擇最佳抗體的時間，有效促進這一過程。

雖然ELISA已被用于篩選先導(dǎo)藥物，但在應(yīng)用ELISA對抗體進行抗體庫篩選時，無法根據(jù)靶點開展排序。Octet^? 系統(tǒng)可識別具有高親和力和低解離速率的克隆，以便進一步表征。目前解離速率分析非常流行，因為無需知道抗體濃度就能對粗樣品實現(xiàn)快速篩選和評估，如細(xì)菌裂解液等（圖5）。與非標(biāo)記技術(shù)（如Octet^? 系統(tǒng)）一起使用時，該過程只需簡單地將目標(biāo)抗原固定在生物傳感器表面，然后將生物傳感器浸入樣品庫中，從而監(jiān)測抗原和抗體的解離。與親和力較低的候選先導(dǎo)藥物相比，結(jié)合力強的候選先導(dǎo)藥物會表現(xiàn)出較慢的解離速率。

特定抗體的基因序列通常被整合到絲狀噬菌體的DNA序列中。噬菌體在其衣殼表面表達(dá)單鏈抗體scFv，通過感染大腸桿菌并利用其復(fù)制系統(tǒng)連續(xù)展示新噬菌體，這導(dǎo)致了大量scFv的快速生成7。此外，噬菌體淘選是一種將噬菌體展示與所需靶標(biāo)結(jié)合的過程，可以用多個抗原按順序進行，以富集靶向保守表位的抗體8。雜交瘤與噬菌體展示技術(shù)存在根本性的差異。與雜交瘤技術(shù)相比，噬菌體展示技術(shù)被認(rèn)為更為通用、強大且快速。它也被廣泛應(yīng)用于體外方法，使得候選藥物的親和力成熟更容易控制。利用這兩種技術(shù)都可以進行解離速率排序，以便加快先導(dǎo)藥物的選擇過程。

雜交瘤和噬菌體展示方法旨在針對每個靶點產(chǎn)生大量抗體。根據(jù)結(jié)合靶點表位的相似性，這些抗體通常需要歸類到不同的“組”中，因為相似的表位會表現(xiàn)為相似的功能。因此，表位分組是一種被廣泛應(yīng)用的先導(dǎo)藥物選擇技術(shù)。在這一過程中，單克隆抗體以成對的方式或組合的方式相互競爭，以便與特定抗原結(jié)合。表位組是指在被測試的單克隆抗體組中代表的單個表位。因此，如果兩個單克隆抗體具有相同的阻斷效應(yīng)，則它們同屬于一個組。由于用計算機預(yù)測B細(xì)胞表位極具挑戰(zhàn)，表位分組技術(shù)仍然是一個依賴經(jīng)驗的過程6，其中非標(biāo)記分析技術(shù)發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。表位分組主要使用三種形式（圖6）；預(yù)混法、夾心法、以及串聯(lián)法。在這三種方法中，最常用的是傳統(tǒng)的夾心分析法，即將一種抗體固定在固體表面（生物傳感器或芯片表面），然后結(jié)合上目標(biāo)分子（抗原），最后通過檢測第二個抗體組的結(jié)合來進行篩選。串聯(lián)法也很常見，該方法是首先固定抗原，然后結(jié)合第一個抗體，再篩選另一組抗體。預(yù)混法使用較少，主要是因為預(yù)混合的樣品之間需要較高的比率，這使得該方法的成本相對更高。所有這些方法的目的都是通過評估每個連續(xù)結(jié)合步驟，并根據(jù)結(jié)合圖譜的相似性將篩選出的抗體進行分組。雖然有許多非標(biāo)記技術(shù)能夠進行表位分組，但考慮到需要篩選的候選物數(shù)量，高通量儀器往往更適合這種應(yīng)用。由于經(jīng)常需要嘗試使用多種方法，特別是當(dāng)一種方法的結(jié)合響應(yīng)不甚明確時，像Octet^?  RH96這樣的系統(tǒng)無疑是一個最理想的選擇。它具有前所未有的高通量，并可以靈活的運行所有三種分析方法。

雖然目前開發(fā)的大多數(shù)新型生物藥仍集中在單克隆抗體上，但越來越多的更具療效潛力的新型分子正在獲得人們的關(guān)注。這些分子包括雙特異性和三特異性抗體、抗體藥物偶聯(lián)物和細(xì)胞療法。雙特異性抗體（bsAb）由Nisonoff和Rivers于1961年首次報道，且越來越受歡迎。迄今為止，市場上有兩種雙特異性抗體藥物（博納吐單抗和艾美賽珠單抗），另有85多種正在臨床開發(fā)中。由于bsAb是由多種不同成分組成，包括多種不同的形式（包括以對稱或不對稱的方式對抗體片段進行各種組裝），因此在研發(fā)過程中對bsAb的功能評估是至關(guān)重要且具有挑戰(zhàn)性。靶向組裝的雙特異性通常在細(xì)胞內(nèi)共同產(chǎn)生；有一些是構(gòu)象不同，而另一些則可能包含兩個預(yù)定結(jié)合表位的部分。因此，研究人員迫切需要簡單的方法，以便在功能上評估兩種或兩種以上的復(fù)合雙特異性治療方法。ELISA和SPR是目前最常用的bsAb評估方法；但這兩種方法都耗時較長。最近的研究表明Octet^? 系統(tǒng)對于功能評估和效價測定可能是一種更好更快的方法，例如在藥物早期發(fā)現(xiàn)過程中開展高質(zhì)量的候選克隆選擇。如果僅通過滴度進行篩選時，大量高質(zhì)量候選克隆可能會被淘汰。高通量Octet^?  RH96系統(tǒng)的最新研究9展示了一種結(jié)合效價測定和功能評估的方法，用以對各組bsAb的進行抗原檢測，從而識別具有特異性抗原結(jié)合的高濃度的pool和克隆。這項研究需要將特定抗原固定到生物傳感器表面，然后通過評估對固定化抗原的結(jié)合反應(yīng)來篩選各種克?。▓D7）。該測定方法可與蛋白A結(jié)合串聯(lián)進行，以同時獲取效價信息。