體積排阻色譜（SEC），也稱為凝膠過濾（Gel Filtration Chromatography，簡稱GF）是一種基于分子大小和形狀進行分離的層析技術(shù)，其原理主要依賴于分子篩效應(yīng)。

凝膠過濾層析利用多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的球形凝膠顆粒作為固定相，當(dāng)樣品通過凝膠柱時，大小和形狀不同的分子會以不同的路徑和速度通過柱體。

凝膠過濾層析屬于非吸附式層析，不依賴于分子與固定相之間的吸附作用，而是根據(jù)分子大小的差異來實現(xiàn)分離。這種分離方式的優(yōu)點是操作簡單、溫和，對樣品的活性影響較小¹。

凝膠過濾填料是由球狀（beads）的多孔基質(zhì)組成，基質(zhì)較為惰性且吸附性較低。樣品進入色譜柱后：

圖1：典型的高分辨率SEC分離示意圖

凝膠過濾層析柱主要有三類，分別是制備型、分析型、組分分離型。

圖2：幾款SEC明星產(chǎn)品

Ve為洗脫體積，Vo為外水體積，Vc為柱體積。Kav是分配系數(shù)，代表分子的入孔能力。

圖3：層析術(shù)語及其示意圖

緩沖液和樣品組成是實現(xiàn)高分辨率的重要因素。蛋白質(zhì)的性質(zhì)（如電荷基團數(shù)量、疏水性和大?。绊慡EC的分離。

因此，填料必須在多種緩沖液中保持化學(xué)穩(wěn)定，并盡可能減少由于樣品和填料之間的相互作用而導(dǎo)致的保留時間、峰面積和分離度的變化。SEC應(yīng)用中通常使用pH值在6.0-8.0之間的緩沖液，因為許多蛋白質(zhì)在該pH范圍內(nèi)是穩(wěn)定的。50 mM磷酸鹽、150 mM氯化鈉（pH值為7.0）的緩沖液適用于許多SEC分離。

此外，選擇對目標(biāo)蛋白質(zhì)有益的離子強度也很重要。離子強度過高也可能會增加填料和蛋白質(zhì)之間的疏水相互作用，從而影響保留時間以及峰面積和分離度。

樣品粘度增加對于分離度的影響很小，但可能會導(dǎo)致色譜柱上的背壓增加。

對于高粘度溶液和/或低溫溶液，請使用較低的運行流速。當(dāng)運行高粘性樣品（例如含有甘油的樣品）時，如果在上樣期間背壓增加，則可能需要稀釋樣品或降低流速。粘度隨溫度而變化。如果樣品與所用緩沖液的粘度相差不超過1.5倍，通常不會影響分離。

如果樣品的粘度非常高，則可以通過增加洗脫液的粘度來補償，例如添加蔗糖或葡聚糖。

另請注意，液體的粘度隨著鹽濃度的增加而增加。混合有機溶液也會影響粘度，例如50%乙醇溶液的粘度遠(yuǎn)高于純水和100%乙醇。具體的推薦流速可參考各產(chǎn)品說明書。圖4為Superdex 30 Increase 10/300 GL層析柱推薦的最大流速。

圖4：Superdex 30 Increase 10/300GL推薦的最大運行流速

定期清潔層析柱（例如每運行3-5次后）將延長其壽命，并有助于實現(xiàn)層析柱的最佳性能。

清潔可去除可能積聚在色譜柱上的任何沉淀蛋白質(zhì)或其他污染物。除了常規(guī)清潔外，如果您在柱床頂部看到變色或背壓大幅增加，您也應(yīng)該清洗層析柱。

SEC層析柱對高pH具有良好的耐受，可以用NaOH多次清洗。NaOH的濃度取決于填料類型：Superose和Superdex色譜柱使用0.5 M NaOH，而Sephacryl層析柱僅使用0.2 M NaOH。

不建議清潔用于脫鹽/緩沖液置換且含有Sephadex的一次性產(chǎn)品。切勿將層析柱存儲在NaOH中。相反，清洗后立即用兩倍柱體積（CV）的水沖洗層析柱，然后用兩倍柱體積的運行緩沖液平衡層析柱。詳細(xì)的清潔方案可參考各產(chǎn)品的說明書。

當(dāng)您超過2天不使用層析柱時，請將其儲存在20%乙醇中。

此外，為防止空氣進入色譜柱，請將shipping device（如圖5所示，紅色柱頂端上方連接的形似“針筒“的小裝置，如果產(chǎn)品中已附帶）連接到色譜柱出口。

圖5：Increase層析柱頂端連入shipping device

少量空氣通常不會影響層析柱的性能。

可用脫氣緩沖液低流速下沖洗層析柱來去除小氣泡。確保緩沖液、系統(tǒng)和層析柱都具有相同的溫度，尤其是緩沖液已儲存在冰箱或冷藏室中時。將層析柱連接到系統(tǒng)時，確保系統(tǒng)的所有部件（包括管路）都充滿液體，以防止空氣進入系統(tǒng)。

如果觀察到柱床內(nèi)的填料出現(xiàn)裂縫，如圖6所示，此時層析柱內(nèi)有較多氣體。請檢查層析系統(tǒng)和層析柱是否出現(xiàn)了漏液的情況²，此時層析柱可能需要重新進行裝填。

圖6：柱床出現(xiàn)裂縫

的Superdex Increase和Superose Increase層析柱可以使用標(biāo)準(zhǔn)的1/16接頭接入傳統(tǒng)HPLC系統(tǒng)，用于分析目的，例如質(zhì)量控制。

初次使用建議先以較低的流速運行，防止超壓，后續(xù)可根據(jù)層析柱的壓力情況調(diào)整運行流速。

1.CY12707-03Dec20-HB. Principles and methods size exclusion chromatography.

2.CY18970-02Feb20-PD. Maintenance and cleaning of size exclusion chromatography columns.