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快問快答 | 族特異親和填料篇

來源：Cytiva（思拓凡） 更新時(shí)間：2025-12-19 09:30:23 閱讀量：85
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Heparin親和填料：老而彌堅(jiān)再戰(zhàn)江湖

蛋白純化中的核酸去除解決方案

食品安全，Cytiva來守護(hù)：Heparin助力食品中乳鐵蛋白含量檢測

Q4

蛋白樣品，第一步使用Ni柱純化，洗脫液中含有500 mM咪唑，能否直接上Heparin填料？

Heparin填料能耐受高濃度咪唑，沒有化學(xué)穩(wěn)定性問題，但是含有500 mM咪唑的緩沖液具有高電導(dǎo)率，這會(huì)影響肝素的陽離子交換作用和氫鍵作用，從而影響蛋白的結(jié)合，所以建議去除咪唑后再上樣，可以通過Cytiva脫鹽柱將樣品快速置換到合適的緩沖體系中。

相關(guān)閱讀：

智薈錦囊之脫鹽柱你用對了嗎？

Q5

Heparin填料的保存條件？為什么要加乙酸鈉？

保存條件：20%乙醇+0.05 M乙酸鈉，4-30 ℃。肝素本身在低pH不穩(wěn)定，因此使用時(shí)應(yīng)該避免pH＜4的條件，儲(chǔ)存時(shí)在20%乙醇中加入0.05 M乙酸鈉，可以避免長期儲(chǔ)存過程中pH降低影響配基的穩(wěn)定性。

Q6

Blue填料的純化原理和應(yīng)用案例？

Blue填料的配基是Cibacron Blue 3G-A分子，呈藍(lán)色，其與目標(biāo)分子間的作用力主要包括：

（1）靜電相互作用：配基上存在磺酸基團(tuán)；

（2）疏水相互作用：配基上存在芳香環(huán)結(jié)構(gòu)；

（3）核苷酸特異性：配基在結(jié)構(gòu)上與一系列核苷酸輔因子（例如NAD+等）相似，從而具有結(jié)合相應(yīng)蛋白的活性。

應(yīng)用案例請參考：

Blue配基應(yīng)用介紹

圖2：Cibacron Blue 3G-A配基的分子結(jié)構(gòu)【2】

Q7

Benzamidine填料的純化原理和應(yīng)用場景？

Benzamidine填料的配基是對氨基苯甲脒（p-aminobenzamidine，簡稱pABA），是絲氨酸蛋白酶的廣譜抑制劑，能夠特異性地結(jié)合trypsin?like絲氨酸蛋白酶的活性位點(diǎn)，形成可逆的離子/氫鍵相互作用?？梢赃x擇低pH洗脫（0.05 M Glycin, pH 3.0 or 10 mM HCl, 0.5 M NaCl, pH 2.0）或者競爭性洗脫（20 mM pABA in binding buffer）。

圖3：對氨基苯甲脒配基的分子結(jié)構(gòu)【3】

常見的應(yīng)用場景：

（1）純化絲氨酸蛋白酶、胰蛋白酶和類胰蛋白酶；

（2）去除酶切產(chǎn)物中的Thrombin或者Factor Xa等絲氨酸蛋白酶；

（3）吸附宿主細(xì)胞裂解液釋放的絲氨酸蛋白酶類，穩(wěn)定目的蛋白，改善降解問題。

Q8

Con A和Lentil Lectin填料的區(qū)別？

Con A填料的配基是刀豆蛋白A，是從刀豆中分離得到的一種四聚體金屬蛋白【4】。Lentil Lectin填料的配基是扁豆凝集素，是從一種扁豆種子中分離出來的金屬蛋白，有兩款填料，Lentil Lectin Sepharose 4B和Capto Lentil Lectin，后者是升級(jí)款【5】。這兩類填料結(jié)合的糖蛋白的種類與結(jié)構(gòu)有差異，所以需要針對樣品進(jìn)行測試和篩選，如表2所示。

表2：凝集素的特異性【6】

在純化時(shí)，結(jié)合緩沖液中需含有Ca2+ 和Mn2+，可以選擇競爭性洗脫（含終濃度為0.1-0.2 M α-D-甲基甘露糖苷或α-D-甲基葡萄糖苷的緩沖液），也可以選擇硼酸鹽緩沖液（0.1 M borate buffer, pH 6.5）或低pH（pH≥4）洗脫。

更多信息請參考：

淺談植物凝集素Con A及其應(yīng)用

Q9

Con A和Lentil Lectin填料，在純化過程中不小心引入了EDTA，怎么辦？

Con A和Lentil Lectin填料的配基都是金屬蛋白，金屬離子對于配基的活性有重要作用，所以純化過程中，不建議使用EDTA這類螯合劑，可能會(huì)將Ca2+和Mn2+從配基上剝離。再生后補(bǔ)充Ca2+ 和Mn2+雖然可以恢復(fù)填料的結(jié)合功能，但是結(jié)合能力會(huì)略有下降，建議重新評估填料的載量。

Q10

Calmodulin填料的純化原理？

Calmodulin Sepharose 4B的配基是從Bovine Testis中天然提取的鈣調(diào)蛋白【7】，其與Ca2+結(jié)合后會(huì)發(fā)生構(gòu)象變化，暴露出疏水性結(jié)合口袋，用于捕獲Calmodulin?binding蛋白，形成復(fù)合物。通過添加螯合劑（EDTA、EGTA）? 去除Ca2+，鈣調(diào)蛋白恢復(fù)松弛構(gòu)象，復(fù)合物解離，目標(biāo)蛋白被洗脫。

Q11

Gelatin填料使用注意事項(xiàng)？

Gelatin填料的配基為牛明膠，可與纖連蛋白結(jié)合，具有高特異性【8】。由于纖連蛋白能吸附在玻璃上，為了避免蛋白損失，純化器具建議選擇硅化玻璃或者聚丙烯（Polypropylene，PP）材質(zhì)。

Q12

Streptavidin Sepharose HP填料的應(yīng)用場景？

Streptavidin Sepharose HP填料主要有3個(gè)應(yīng)用場景【9】：

（1）純化生物素化的蛋白；

（2）純化2-亞氨基生物素標(biāo)記的蛋白；

（3）結(jié)合生物素化的抗體去捕獲抗原。

純化條件請參考說明書。

Q13

ECH-Lysine Sepharose 4 FF填料的應(yīng)用場景？

ECH-Lysine Sepharose 4 FF填料的配基是L-賴氨酸，可用于純化血纖維蛋白溶酶原及血纖維蛋白溶酶原激活劑。是一款耐堿性的親和填料：0.1 M NaOH、20 ℃，400天后載量依然穩(wěn)定【10】。

圖4：L-賴氨酸配基的分子結(jié)構(gòu)

圖5：L-賴氨酸配基耐堿穩(wěn)定性測試數(shù)據(jù)

Q14

IgG Sepharose 6 FF填料能否用來純化Protein G或者Protein L蛋白？

可以，IgG Sepharose 6 FF填料上偶聯(lián)的配基是人的多克隆抗體，含有不同亞型的IgG，能與Protein G或者Protein L蛋白結(jié)合。

Q15

能否利用IgG Sepharose 6 FF填料和Calmodulin填料串聯(lián)純化蛋白復(fù)合物？

可以，如圖6所示，串聯(lián)親和層析（Tandem affinity purification，TAP）的基本原理是將一個(gè)誘餌蛋白（一個(gè)已知或假想的復(fù)合物組分）同時(shí)帶上蛋白A和鈣調(diào)素結(jié)合肽（CBP）兩個(gè)標(biāo)簽，在這兩個(gè)標(biāo)簽之間添加煙草花葉病毒酶（TEV）酶切位點(diǎn)。利用連續(xù)兩步親和層析來分離蛋白復(fù)合物。兩步親和層析的目的是提高純化過程的特異性繼而降低假陽性出現(xiàn)的幾率。純化條件溫和，能保持復(fù)合物的完整性。

具體請掃碼觀看直播：《線上專題課程 【智薈直播間】珠聯(lián)壁合：基因與蛋白研究之磁珠應(yīng)用| 思拓凡學(xué)堂中國官網(wǎng)》

圖6：IgG Sepharose和Calmodulin Sepharose親和填料串聯(lián)純化蛋白復(fù)合物示意圖【11】

Q16

Alpha-1 Antitrypsin Select填料的應(yīng)用場景？

Alpha-1 Antitrypsin Select填料的配基是一種單域抗體片段，由酵母發(fā)酵表達(dá)，對α-1抗胰蛋白酶具有高選擇性親和作用，可用于從血漿以及重組或轉(zhuǎn)基因來源的樣品中純化α-1抗胰蛋白酶。

Q17

凝血因子親和填料的種類和應(yīng)用？

VIISelect / VIIISelect / IXSelect三種填料分別特異性親和凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX，三種配基是不同特異性的單域抗體片段，由酵母發(fā)酵表達(dá)，均無動(dòng)物來源。

Q18

PlasmidSelect填料的純化原理和質(zhì)粒生產(chǎn)工藝？

PlasmidSelect填料的配基2-巰基吡啶是一種小分子【12】，可用于分離開環(huán)和超螺旋質(zhì)粒DNA，提高質(zhì)粒的均一性。有兩款填料，PlasmidSelect Xtra（載量 >2 mg 超螺旋質(zhì)粒/mL）和升級(jí)款Capto PlasmidSelect （載量≥ 3.0 mg 超螺旋質(zhì)粒/mL），收率一般>70%，收率低時(shí)可考慮延長洗脫液的孵育時(shí)間。PlasmidSelect填料的純化原理和質(zhì)粒生產(chǎn)工藝，請點(diǎn)擊下方鏈接查看：

PlasmidSelect質(zhì)粒親和層析機(jī)理淺析

淺談質(zhì)粒生產(chǎn)工藝的開發(fā)進(jìn)程

Q19

AVB填料的應(yīng)用案例？

AVB填料的配基是釀酒酵母表達(dá)的單域抗體片段，非動(dòng)物來源，可以特異性地捕獲AAV1，2，3，5等亞型，能有效去除工藝相關(guān)雜質(zhì)（如HCP等），但是其無法區(qū)分完整病毒和空殼病毒，去除空殼病毒可以再加一步陰離子交換層析，如Capto Q ImpRes或Capto Q。應(yīng)用案例請掃碼參考：Enhanced AAV downstream processing

圖7：AAV的生產(chǎn)工藝流程

以及完整病毒和空殼病毒的電荷性質(zhì)差異【13】

Q20

Capto DeVirS填料的應(yīng)用案例？

Capto DeVirS填料的配基為硫酸葡聚糖，可以和多數(shù)病毒表面蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，如流感病毒、呼吸道合胞病毒、黃熱病毒、慢病毒等，其結(jié)合機(jī)理并未有公開報(bào)道的嚴(yán)謹(jǐn)說明，目前推測結(jié)合發(fā)生在硫酸葡聚糖的羥基（氫鍵）和磺酸基（離子鍵）。應(yīng)用案例請參考：

Capto DeVirS填料在疫苗工藝開發(fā)中的應(yīng)用

圖8：硫酸葡聚糖配基的分子結(jié)構(gòu)【14】

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參考文獻(xiàn)

1.      Capto Heparin. Data File, CY13684-07Aug20-DF.

2.      Blue Sepharose 6 FF. Data File, CY13325-11May20-DF.

3.      Benzamidine Sepharose 4 FF (HS). Data File, CY14297-11Sep20-DF.

4.      Con A Sepharose 4B. Data File, CY13570-20Jul20-DF.

5.      Capto Lentil Lectin. Data File, CY13711-27May21-DF.

6.      Affinity Chromatography Vol. 3: Specific Groups of Biomolecules, CY13979-04Feb21-HB.

7.      Calmodulin Sepharose 4B. Instructions for Use, 71707600 AE.

8.      Gelatin Sepharose 4B. Instructions for Use, 71709400 AH.

9.      HiTrap Streptavidin Sepharose High Performance. Instructions for Use, 71500439 AL.

10.    ECH-Lysine Sepharose 4 FF. Data File, CY13470-6Aug20-DF.

11.    Principles and methods: Purifying challenging proteins. CY14791-20Jan21-HB.

12.    Capto PlasmidSelect. Data File, CY11779-27Feb20-DF.

13.    Separation of full and empty AAV capsids by anion exchange, CY28706-10May22-PT.

14.    Capto DeVirS. Data File, CY13449-15Jul20-DF.

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