#干細(xì)胞分化#基質(zhì)剛度#蛋白質(zhì)束縛#

  干細(xì)胞通過(guò)與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的結(jié)合和收縮來(lái)調(diào)控自身的命運(yùn)。ECM的剛度能夠調(diào)控細(xì)胞的短期功能如細(xì)胞鋪展，以及長(zhǎng)期功能如干細(xì)胞和平滑肌前體細(xì)胞在二維平面上的表型變化。在二維環(huán)境中，共同的肌球蛋白介導(dǎo)的收縮機(jī)制對(duì)于基質(zhì)誘導(dǎo)的分化至關(guān)重要。然而，在三維環(huán)境下，需要一種不穩(wěn)定或可降解的基質(zhì)，允許細(xì)胞首先鋪展并隨后與ECM黏附才能實(shí)現(xiàn)分化。力介導(dǎo)的ECM蛋白質(zhì)展開也會(huì)隨著剛度的不同而調(diào)控細(xì)胞反應(yīng)。雖然構(gòu)建三維基質(zhì)已成為理解基質(zhì)如何影響細(xì)胞命運(yùn)的廣泛方法，但在二維環(huán)境下，基底固定的纖維狀蛋白質(zhì)形變?nèi)绾握{(diào)控干細(xì)胞命運(yùn)仍不明確。

  有研究提出，除了基質(zhì)剛度和配體類型外，纖維蛋白與底層基底表面的耦合程度，即錨定和基質(zhì)孔隙度，也會(huì)影響干細(xì)胞的分化。還有研究提出ECM提供的機(jī)械阻力，對(duì)抗肌球蛋白介導(dǎo)的收縮并引發(fā)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和分化，可能是由于蛋白質(zhì)錨定而非基質(zhì)剛度在平面培養(yǎng)中的作用。因此，有必要分離蛋白質(zhì)錨定和基底剛度這兩個(gè)因素，并確定它們是否以及如何共同調(diào)控干細(xì)胞分化。Adam J Engler團(tuán)隊(duì) 2014年10月在Nature materials發(fā)表題為“Interplay of Matrix Stiffness and Protein Tethering in Stem Cell Differentiation”的文章，該研究發(fā)現(xiàn)在二維平面上，基質(zhì)剛度獨(dú)立于蛋白質(zhì)錨定和孔隙度，單獨(dú)調(diào)控干細(xì)胞分化。

  首先，研究者通過(guò)調(diào)整丙烯酰胺單體和雙丙烯酰胺交聯(lián)劑的比例產(chǎn)生三種不同剛度的水凝膠，分別對(duì)應(yīng)脂肪組織、肌肉和類骨質(zhì)的剛度，又調(diào)整丙烯酰胺單體和雙丙烯酰胺交聯(lián)劑的比例改變聚丙烯酰胺（PA）水凝膠的孔隙率，對(duì)比相似剛度每種水凝膠之間的體積和質(zhì)量溶脹比的差異，發(fā)現(xiàn)每個(gè)基底亞組之間的孔隙率存在顯著差異，表明水凝膠孔隙度與剛度無(wú)關(guān)。利用電鏡掃描證明孔徑隨著丙烯酰胺濃度的增加和雙丙烯酰胺濃度的降低而增加。接下來(lái)研究者將人脂肪來(lái)源干細(xì)胞(ASCs) 、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）培養(yǎng)在不同剛度的水凝膠上，堿性磷酸酶（ALP）染色的結(jié)果顯示孔隙率并不影響兩種細(xì)胞的分化，但剛度會(huì)明顯影響兩種細(xì)胞的分化。由于細(xì)胞-ECM信號(hào)傳導(dǎo)依賴于收縮力，而且收縮力差異可以調(diào)控分化，接下來(lái)研究者利用牽引力顯微鏡（TFM）觀察到相同剛度的水凝膠的平均位移相似，但不同剛度的水凝膠之間的平均位移不同，再次證明孔隙率和干細(xì)胞分化無(wú)關(guān)，剛度可能影響細(xì)胞分化。

  在合成水凝膠上培養(yǎng)細(xì)胞需要通過(guò)蛋白質(zhì)-交聯(lián)劑（如磺基-SANPAH）將細(xì)胞與粘附性基質(zhì)蛋白（如Ⅰ型膠原蛋白）共價(jià)結(jié)合到水凝膠表面。為了調(diào)控纖維狀膠原蛋白與PA水凝膠的錨定，研究者通過(guò)調(diào)整磺基-SANPAH濃度來(lái)改變表面錨定點(diǎn)密度，從而改變相鄰錨定點(diǎn)之間的平均距離。通過(guò)使用抗Ⅰ型膠原蛋白抗體功能化的探針，在一系列磺基-SANPAH濃度下激活基底。當(dāng)探針從表面收回時(shí)，膠原蛋白會(huì)逐漸展開或拉伸，直到抗體-蛋白鍵斷裂,通過(guò)對(duì)力譜圖進(jìn)行分析，可以定位破裂事件，并確定破裂力（即打斷蛋白質(zhì)-抗體鍵所需的力）以及破裂長(zhǎng)度（即膠原纖維段在破裂時(shí)的偏轉(zhuǎn)量）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著磺酸化-SANPAH濃度增加，破裂長(zhǎng)度減小，且破裂力并未發(fā)生實(shí)質(zhì)性變化。接下來(lái)研究者發(fā)現(xiàn)無(wú)論磺胺-SANPAH 濃度、水凝膠配方和細(xì)胞類型如何，在所有 30 kPa 水凝膠上均觀察到細(xì)胞分化，說(shuō)明膠原蛋白與基質(zhì)表面的結(jié)合程度對(duì)干細(xì)胞的分化沒(méi)有影響。為了進(jìn)一步確認(rèn)分化結(jié)果，研究者使用牽引力顯微鏡繪制了水凝膠在一系列磺基-SANPAH 濃度范圍內(nèi)的底物位移，結(jié)果顯示嵌入水凝膠中的珠子的平均位移與磺基-SANPAH 濃度變化無(wú)關(guān)，僅取決于基質(zhì)模量。隨后研究者又利用一種來(lái)自纖維連接蛋白短的細(xì)胞粘附肽，通過(guò)在聚合過(guò)程中加入丙烯酸酯-PEG-RGD，使粘附蛋白直接結(jié)合到聚丙烯酰胺骨架中從而沒(méi)有蛋白束縛力，在此條件下培養(yǎng)人脂肪來(lái)源干細(xì)胞(ASCs) 、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC），發(fā)現(xiàn)在沒(méi)有纖維蛋白束縛的情況下細(xì)胞依然會(huì)發(fā)生分化，說(shuō)明束縛力與干細(xì)胞分化無(wú)關(guān)。

  接下來(lái)研究者為了證明在沒(méi)有纖維蛋白束縛的情況下，剛度誘導(dǎo)的分化是可能的，通過(guò)在聚合過(guò)程中加入丙烯酸酯-PEG-RGD（而不是將粘附蛋白拴在底物上），直接摻入聚丙烯酰胺主鏈中，觀察在沒(méi)有蛋白質(zhì)系鏈的情況下細(xì)胞在 PA-PEG-RGD 水凝膠上鋪展情況，發(fā)現(xiàn)ASCs在10/0.3 ，30 kPa水凝膠上發(fā)生成骨分化，與RGD濃度無(wú)關(guān)，并且細(xì)胞產(chǎn)生的底物位移與膠原包被的水凝膠相似。為進(jìn)一步確定這種現(xiàn)象的普遍性，又利用不同的基材二甲基硅氧烷 (PDMS)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，調(diào)節(jié)其剛度同樣可以觀察到細(xì)胞黏附和擴(kuò)散，并且細(xì)胞擴(kuò)散面積在所有基底上相似，說(shuō)明細(xì)胞可能在二甲基硅氧烷 (PDMS) 不同配方上感受到類似的機(jī)械信號(hào)。

  鑒于測(cè)量PDMS材料力學(xué)性能的方法缺乏共識(shí)，選擇Z恰當(dāng)?shù)募夹g(shù)以精確模擬細(xì)胞與基底間的相互作用至關(guān)重要。細(xì)胞以20至120納米/秒的速度對(duì)抗并拉動(dòng)基底，導(dǎo)致的形變程度與基底剛度呈反比關(guān)系。為了模擬這些動(dòng)態(tài)變化的拉力事件，研究者調(diào)整AFM探針的回縮速度以匹配細(xì)胞的拉動(dòng)速度和焦點(diǎn)的大小，并通過(guò)分析AFM獲得的回縮曲線（而非壓入曲線）來(lái)實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。當(dāng)探針在表面上方拉伸并使材料發(fā)生形變時(shí)可通過(guò)擬合從接觸點(diǎn)到達(dá)到-100 pN力值之間的線性區(qū)域來(lái)確定基底的剛度。結(jié)果顯示100:1 PDMS具有高度粘彈性，而50:1 PDMS主要表現(xiàn)為彈性，兩者在與細(xì)胞相關(guān)應(yīng)變條件下都保持較高剛度，這與先前的研究結(jié)果一致。在細(xì)胞進(jìn)行力學(xué)感知的尺度，無(wú)論是50:1還是100:1 PDMS基底，其剛度均高于30 kPa PA水凝膠，這一發(fā)現(xiàn)合理解釋了為何細(xì)胞鋪展和成骨分化不受固化比例影響。

  綜上所述，該研究通過(guò)調(diào)節(jié)基質(zhì)孔隙率而不改變聚丙烯酰胺凝膠的剛度，發(fā)現(xiàn)不同的基質(zhì)孔隙率不會(huì)顯著改變?nèi)祟愔緛?lái)源的干細(xì)胞和骨髓來(lái)源的間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的蛋白質(zhì)束縛、基質(zhì)變形或成骨和成脂分化。高達(dá)50倍的蛋白質(zhì)-底物連接體密度的變化改變了蛋白束縛，但不影響成骨、脂肪生成、表面蛋白質(zhì)展開或潛在的底物變形。細(xì)胞分化也不受蛋白質(zhì)束縛的影響。該研究結(jié)果表明，平面基質(zhì)的剛度獨(dú)立于蛋白質(zhì)束縛和孔隙率調(diào)節(jié)干細(xì)胞分化。

原文鏈接：https://www.nature.com/articles/nmat4051

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  通過(guò)解讀這篇文章，大家也了解到水凝膠硬度會(huì)影響水凝膠變形產(chǎn)生的機(jī)械力從而影響干細(xì)胞分化，強(qiáng)調(diào)了機(jī)械力對(duì)干細(xì)胞分化的影響，檢測(cè)這種機(jī)械力離不開一種工具就是“牽引力顯微鏡”，在此極力向大家推薦一款好用且先進(jìn)的Plexithermo牽引力顯微鏡，想要詳細(xì)了解牽引力顯微鏡產(chǎn)品信息，可掃描二維碼添加客服咨詢或撥打心動(dòng)康達(dá)咨詢電話4006868992。