目前空間多組學(xué)技術(shù)已用于研究幾種類(lèi)型癌癥中腫瘤免疫微環(huán)境的轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和代謝組，從這些方法獲得的數(shù)據(jù)已與免疫組化和多參數(shù)分析相結(jié)合，以產(chǎn)生癌癥進(jìn)展的標(biāo)記物。傳統(tǒng)分析技術(shù)受樣品空間分辨率以及分析靈敏度的限制，無(wú)法精準(zhǔn)獲取靶向部位，而對(duì)其中特異代謝物的差異表征就更加困難。組織切片伴隨著顯微鏡技術(shù)等的發(fā)展而得到廣泛的應(yīng)用，而激光顯微切割 (LMD, laser microdissection) 技術(shù)（如使用Leica LMD6/7）可以方便地對(duì)特定的組織區(qū)域進(jìn)行精確分離（圖2）。結(jié)合高靈敏度的液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)技術(shù)，基于SCIEX的ZenoTOF^? 7600 系統(tǒng)，將空間定位準(zhǔn)確的微區(qū)細(xì)胞代謝譜進(jìn)行全面準(zhǔn)確的表征。代謝譜是免疫微環(huán)境的重要調(diào)節(jié)因子，可能通過(guò)影響癌細(xì)胞的增殖潛能和適應(yīng)環(huán)境而發(fā)揮作用。代謝特征的異質(zhì)性似乎有助于腫瘤免疫微環(huán)境的異質(zhì)性。

由制備好的腫瘤組織切片樣本置于激光顯微切割載物臺(tái)，確定好焦距平面后，將視野移動(dòng)到待切割的細(xì)胞區(qū)域（先通過(guò)H&E染色的平行樣本確定腫瘤組織分區(qū)），在調(diào)節(jié)好相關(guān)參數(shù)后開(kāi)始進(jìn)行切割。通過(guò)對(duì)樣本分別進(jìn)行水溶性代謝物和脂溶性代謝物的提取，進(jìn)而進(jìn)行基于液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)的全面的代謝組學(xué)分析。

圖2. 組織切片樣本用于激光顯微切割分離體制備。經(jīng)過(guò)蘇木精-伊紅（HE）染色確定組織切片中不同類(lèi)型的細(xì)胞區(qū)域（左）包括原位癌、浸潤(rùn)癌和癌旁細(xì)胞，在平行的未染色組織切片中的相應(yīng)位置進(jìn)行激光顯微切割獲得分離體（右）。

Leica 激光顯微切割系列產(chǎn)品利用UV激光可直接從組織切片制備分子生物分析所需的樣品，可用于基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄物組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝物組學(xué)和活細(xì)胞應(yīng)用等的快速、精確且高質(zhì)量的切割。

組織細(xì)胞中代謝物成分復(fù)雜多樣，且有較多同分異構(gòu)體，僅有準(zhǔn)確的高分辨一級(jí)無(wú)法對(duì)化合物進(jìn)行確證。針對(duì)大量樣本，SCIEX OS軟件可自動(dòng)進(jìn)行峰提取和搜庫(kù)，通過(guò)一級(jí)質(zhì)量數(shù)、同位素豐度和二級(jí)碎片的匹配對(duì)樣本中的代謝物進(jìn)行鑒別（圖3），使篩查流程快速準(zhǔn)確。在代謝組學(xué)的樣本中共鑒定173個(gè)化合物，包括氨基酸類(lèi)、核苷類(lèi)、吲哚類(lèi)、脂肪酸類(lèi)等。

圖4. 代謝物鑒定界面示例。以樣本中鑒定到的脯氨酸（Proline）為例，Proline分子式為C₅H₉NO₂，檢測(cè)到的MS信號(hào)與理論質(zhì)荷比相比，質(zhì)量數(shù)偏差為-0.3ppm，同位素豐度比與理論值偏差為1.3%，MSMS與代謝物庫(kù)中Proline的標(biāo)準(zhǔn)譜圖匹配度為100，以此可判定鑒定到的信號(hào)為Proline。

在脂質(zhì)組學(xué)分析樣本中共鑒定到550個(gè)脂質(zhì)化合物，基于ZenoTOF 7600 系統(tǒng)特有的電子活化解離（EAD）碎裂模式，可以鑒定出其中一些脂質(zhì)化合物的精細(xì)結(jié)構(gòu)，如脂肪酸鏈連接的具體位置（sn1或sn2）以及連接的不飽和脂肪酸雙鍵的具體位置（圖4）；對(duì)于樣本中檢測(cè)到的脂質(zhì)化合物包括固醇酯類(lèi)、神經(jīng)酰胺類(lèi)、溶血磷脂膽堿類(lèi)、磷脂膽堿類(lèi)、溶血磷脂乙醇胺類(lèi)、磷脂乙醇胺類(lèi)、磷脂肌醇類(lèi)、磷脂絲氨酸類(lèi)、鞘酯類(lèi)、甘油二酯類(lèi)、甘油三酯類(lèi)。

圖5. 脂質(zhì)化合物精細(xì)結(jié)構(gòu)鑒定示例。以甘油三酯TG (18:1/18:1/18:1)為例，在EAD碎裂模式下，化合物[M+Na]+峰可以產(chǎn)生特征的碎片離子，幫助解析甘油三個(gè)羥基各自所連接的脂肪酸組成，以及在高質(zhì)荷比區(qū)域產(chǎn)生的連續(xù)CH2斷裂碎片確定不飽和鍵的位置（C9和C10間為雙鍵）。

在質(zhì)控樣本（quality control, QC, 所有樣本等體積混合，整個(gè)分析批次中每6個(gè)樣本穿插一針QC樣本進(jìn)樣）中，化合物峰面積RSD%不超過(guò)30%（n=8），在代謝組學(xué)樣本中共檢出100個(gè)代謝物，脂質(zhì)組學(xué)樣本中共檢出502個(gè)代謝物，并將這些化合物在所有的樣本包括原位癌組織、浸潤(rùn)癌組織、癌旁組織進(jìn)行峰面積提取。

將獲得的各種組織中化合物含量信息進(jìn)行生物統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以浸潤(rùn)癌組織v.s.癌旁組織為例，共找到84個(gè)差異代謝物（圖5）。經(jīng)過(guò)后續(xù)進(jìn)一步生物學(xué)驗(yàn)證，確定的差異代謝物可以幫助開(kāi)展癌細(xì)胞在空間定位及異質(zhì)性的精準(zhǔn)區(qū)分工作，更好的理解例如腫瘤轉(zhuǎn)移的起源和發(fā)展、侵襲能力、對(duì)藥物的敏感性等方面的特點(diǎn)，從而制定個(gè)體化的精準(zhǔn)治療方案。

圖6. 浸潤(rùn)癌組織v.s.癌旁組織中的差異代謝物熱圖。通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，包括t-test的p值小于0.05以及PLSDA計(jì)算的VIP值不小于1作為篩選條件，獲得了84個(gè)差異代謝物。

通過(guò)對(duì)組織切片進(jìn)行激光顯微切割獲取空間定位準(zhǔn)確的微量樣本，并與SCIEX ZenoTOF^? 7600 系統(tǒng)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)微量細(xì)胞水溶性和脂溶性代謝物的全面表征以及高靈敏度組學(xué)分析?？蓪⒋朔桨笐?yīng)用于其他組織切片樣本，助力空間多組學(xué)研究的開(kāi)展。

感謝廈門(mén)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院林樹(shù)海教授及其課題組成員華錚翼、姚博對(duì)方案中組織切片和樣本制備的支持；

感謝丹納赫生命科學(xué)平臺(tái)公司高天龍、連其林對(duì)顯微切割技術(shù)的支持。