結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌（Mtb）引起的常見(jiàn)傳染病，每年影響全球約1000萬(wàn)人，2022年造成130萬(wàn)人死亡。中心壞死性肉芽腫是人類(lèi)結(jié)核病的組織病理學(xué)標(biāo)志，它由富含脂質(zhì)、非血管化的壞死核心組成，毗鄰泡沫狀巨噬細(xì)胞邊緣，并被纖維囊和一層上皮樣巨噬細(xì)胞包圍。在這些壞死病變中，細(xì)胞外 Mtb 可以處于代謝休眠階段，受到免疫系統(tǒng)的良好保護(hù)。此外，由于其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，抗生素?cái)U(kuò)散到這些病變中可能會(huì)受到阻礙。然而，藥物穿透壞死性肉芽腫的能力顯著影響治療效果。因此，抗分枝桿菌候選藥物的高效臨床前篩選和測(cè)試對(duì)于新型療法的快速開(kāi)發(fā)至關(guān)重要。

MALDI質(zhì)譜成像非常適合研究組織樣本中化合物的定位，并且能夠同時(shí)分析組織切片中內(nèi)源性和外源性化合物的分布。然而，組織中藥物化合物的可靠鑒定需要高質(zhì)量分辨率和高質(zhì)量精度，同時(shí)高空間分辨能力能夠確保組織生物學(xué)結(jié)構(gòu)的精準(zhǔn)劃分。因此，本研究采用兼具高空間分辨率、高質(zhì)量分辨率、高質(zhì)量精度和高靈敏度等眾多優(yōu)勢(shì)的AP SMALDI-Orbitrap系統(tǒng)以10μm空間分辨率對(duì)來(lái)自IL-13^tg小鼠模型的中心壞死性肉芽腫中的BTZ-043進(jìn)行分析，確定其在病灶中的動(dòng)態(tài)分布情況。

為了明確病變病理學(xué)與藥物分布的相關(guān)性，作者對(duì)從結(jié)核分枝桿菌Mtb感染的IL-13 ^tg小鼠中（給藥后2小時(shí)處死）獲得的肺組織相鄰冷凍切片分別進(jìn)行H&E染色和高分辨率AP SMALDI-Orbitrap成像。H&E染色顯示兩個(gè)高度分層的肉芽腫，中心為嗜酸性粒細(xì)胞壞死（圖 1a）。兩個(gè)肉芽腫都被一個(gè)突出的纖維包膜包圍（圖 1b），在纖維包膜旁邊檢測(cè)到泡沫狀巨噬細(xì)胞邊緣，其伊紅染色強(qiáng)度較低，但 CD68 陽(yáng)性（圖 1c），并富含脂滴（圖 1d），因此與在人肉芽腫中觀察到的泡沫狀巨噬細(xì)胞非常相似。

MALDI成像顯示，在整個(gè)組織切片中檢測(cè)到BTZ-043，其中肉芽腫區(qū)域豐度更高（圖1e）。與H&E染色結(jié)果進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)該藥物主要分布于肉芽腫的纖維囊內(nèi)，與主要由泡沫巨噬細(xì)胞組成的細(xì)胞區(qū)室重合。作者進(jìn)一步繪制了該藥物在肉芽腫區(qū)域的滲透曲線，其中肉芽腫邊緣（圖1e中藍(lán)色和紫色的線）位于纖維囊和泡沫狀巨噬細(xì)胞區(qū)域之間。從藥物滲透曲線中可以看出，在兩個(gè)肉芽腫中，該藥物強(qiáng)度在邊緣（即巨噬細(xì)胞層）急劇增加，隨后向肉芽腫的中心下降。

圖1 病變病理與BTZ-043滲透相關(guān)性 （a H&E染色；b三色染色；c CD68/ZN染色；d 油紅O染色；e BTZ-043的離子圖像，[M+H]⁺, m/z 432.08355；f 兩個(gè)肉芽腫的BTZ-043滲透曲線。）

為了更詳細(xì)的研究藥物的時(shí)空分布情況，作者通過(guò)MALDI成像研究了最后一次給藥后不同時(shí)間點(diǎn)（0.5h、2h、4h、8h）的小鼠肺切片。H&E染色結(jié)果顯示壞死中心以深紫色可見(jiàn)，其周?chē)臏\紫色區(qū)域代表由泡沫狀巨噬細(xì)胞組成的細(xì)胞區(qū)室（圖2a-d）。

MALDI成像結(jié)果顯示，最后一次給藥后0.5h和2h的BTZ-043分布與圖1所示相似，泡沫巨噬細(xì)胞層的強(qiáng)度高于周?chē)M織，壞死中心的強(qiáng)度較低（圖2e-f）；4h后，該藥物均勻分布在肉芽腫中，并完全穿透壞死中心（圖2g）；給藥后8h，在細(xì)胞隔室和壞死中心仍檢測(cè)到該藥物，而周?chē)M織中的藥物強(qiáng)度下降，表明BTZ-043在中心壞死性肉芽腫中的滯留時(shí)間更長(zhǎng)。

圖2 MALDI成像展示IL-13^tg小鼠中心壞死性肉芽腫中BTZ-043的時(shí)空分布（BTZ-043在0.5 h (a、e）、2 h (b、f）、4 h (c、g）和8 h (d、h）的H&E染色和MALDI成像分布）（點(diǎn)擊查看大圖）

成功的結(jié)核病治療取決于藥物完全穿透含有大多數(shù)分枝桿菌的中心壞死性肉芽腫的能力及其在這些病灶內(nèi)的抗分枝桿菌活性。本研究團(tuán)隊(duì)在確定藥物最佳治療劑量、藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)、體外通透系數(shù)的基礎(chǔ)上，選用能夠形成類(lèi)人中心壞死性肉芽腫的先進(jìn)IL-13^tg小鼠模型，結(jié)合高分辨MALDI成像準(zhǔn)確評(píng)估藥物在組織中的分布以及時(shí)空變化。

本研究開(kāi)創(chuàng)性地可視化呈現(xiàn)了臨床階段結(jié)核藥物在中心壞死性肉芽腫中的有效滲透和積累，并證明了其病變活性，為 BTZ-043 補(bǔ)充現(xiàn)有抗生素的能力提供了重要指示。因此，BTZ-043未來(lái)有助于縮短治療方案，防止結(jié)核病復(fù)發(fā)，并阻止耐藥性的發(fā)展。AP SMALDI- Orbitrap空間代謝組學(xué)技術(shù)有望更深入地應(yīng)用于藥物研發(fā)、臨床前藥物篩選和測(cè)試、疾病研究等領(lǐng)域。

AP-SMALDI 5AF -Orbitrap 質(zhì)譜成像系統(tǒng)

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