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Sera-Mag和Sera-Mag SpeedBead是Cytiva公司生產(chǎn)的高性價比的磁珠產(chǎn)品，適用于核酸分離、免疫分析等多個分子生物學應用領域。本文主要介紹Sera-Mag和Sera-Mag SpeedBead偶聯(lián)蛋白與寡核苷酸的方法與步驟。

蛋白共價偶聯(lián)步驟：一步法

室溫，使用Mixing wheel混合15分鐘。

使用前立即準備52 μmol/mL濃度的EDAC溶液（易水解，請勿提前配制，現(xiàn)用現(xiàn)配），通過移液槍將計算出的體積快速放入反應中、混勻。

室溫混合1 h。

去除未結合的蛋白質，離心沉淀磁珠顆粒（在標準微量離心機中10–30 min），棄上清。

用緩沖液將最終顆粒重懸到所需的比例（%），可以使用MES緩沖液或選擇的更高pH緩液。例如，如果目標磁珠百分比為1.0%，加入0.97 mL緩沖液。

通過BCA法測定結合在磁珠上的蛋白量。

為了獲得長期的穩(wěn)定性，需要放置于穩(wěn)定的儲存液中。蛋白分析后，已經(jīng)共價偶聯(lián)蛋白的磁珠可以重懸于緩沖液中（蛋白共價結合可以承受洗滌劑洗滌或緩沖液更換。因此，共價耦合試劑可以與多種緩沖添加劑兼容）。

活性酯兩步偶聯(lián)法

計算EDAC使用量。方法同一步法中EDAC計算方法。對于兩步偶聯(lián)EDAC: COOH推薦以2.5:1進行滴定，NHS和COOH推薦比例20:1。

室溫，使用Mixing wheel混合30分鐘。

離心去上清。

1 mL of 50 mM MES buffer, pH6.1重懸（在標準微量離心機中10-30分鐘）棄去上清。

添加以下物質并超聲處理來重懸顆粒：

①100 μL 500 mM MES緩沖液：終濃度50 mM。

②加水使反應達到1.0 mL終體積。

加入蛋白樣品快速混合?？梢酝ㄟ^設置梯度，摸索最佳的蛋白偶聯(lián)量。固定EDAC濃度，進行蛋白濃度滴定實驗，建議以蛋白與磁珠質量為25, 50, 75, 100, 150和200 μg/mg進行滴定實驗。

室溫，使用Mixing wheel混合1小時。

去除未結合蛋白（重懸磁珠，棄去上清）。

用緩沖液進行兩次洗滌。可以使用50 mM MES緩沖液或選擇的更高pH緩沖液。通過離心來分離顆粒與清液，2次洗滌之間使用超聲波重懸顆粒。

用緩沖液將最終顆粒重懸到所需的比例（%），可以使用50 mM MES緩沖液或選擇的更高pH緩液。例如，如果目標磁珠百分比為1.0%，加入0.97 mL緩沖液。

通過BCA法測定結合在磁珠上的蛋白量。

為了獲得長期的穩(wěn)定性，需要放置于穩(wěn)定的儲存液中。蛋白分析后，偶聯(lián)蛋白的磁珠可以重懸于不同的緩沖液（共價偶聯(lián)可以耐受洗滌劑和各種添加劑，因此共價反應試劑可以兼容各種添加劑）。

寡核苷酸偶聯(lián)步驟

使用前渦旋儲備磁珠懸浮液確保底部沒有可見的顆?；蛉魏晤w粒團塊緊貼在存儲容器的壁上。

37 °C下進行偶聯(lián)反應過夜保持連續(xù)混合。使用滾輪或搖臂。如果使用瓶子，按從頭到尾的方向放置。不要使用磁力攪拌棒。

用無DNA酶/RNA酶水按全反應體積洗滌兩次（例如，1 mL對1 mL反應體系）。洗滌過程中建議使用磁力架分離磁珠，傾倒上清。

按全反應體積加入0.1 M咪唑（pH6.0）洗滌兩次。37 °C下孵育5分鐘，不斷攪拌。

按全反應體積加入0.1 M碳酸氫鈉洗滌三次。37 °C下孵育5分鐘，不斷攪拌。

按全反應體積加入0.1 M碳酸氫鈉洗滌兩次。65 °C下孵育30分鐘，不斷攪拌。

將磁珠按1%固含量保存于無DNA酶/RNA酶水中，或者依據(jù)下游應用選擇適用保存緩沖液。