在生物制品的生產(chǎn)與應(yīng)用過程中，內(nèi)毒素污染是一個(gè)極易被忽視卻至關(guān)重要的風(fēng)險(xiǎn)因素。內(nèi)毒素超標(biāo)不僅嚴(yán)重影響產(chǎn)品的質(zhì)量和安全性，還可能對(duì)人體造成顯著危害，是生物制藥領(lǐng)域必須嚴(yán)格控制的關(guān)鍵質(zhì)量屬性。

一、內(nèi)毒素的致病機(jī)制

內(nèi)毒素可導(dǎo)致嚴(yán)重的病理生理反應(yīng)，其毒性可造成多種器官功能損傷。內(nèi)毒素或損傷肝細(xì)胞導(dǎo)致肝功能異常，或引起腎臟血管收縮發(fā)生急性腎損傷，或影響心肌細(xì)胞功能造成心率失?；蛐牧λソ叩取?nèi)毒素還可引起腸道菌群失衡，導(dǎo)致腹瀉、嘔吐等胃腸道癥狀。

這些病理變化的根本機(jī)制在于內(nèi)毒素激活了人體先天免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)大量炎癥細(xì)胞分子分泌，如TNF、IL-1、IL-6、IL-8、IFN等。這些細(xì)胞因子通過結(jié)合受體，介導(dǎo)細(xì)胞間的信號(hào)通路，廣泛參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生物學(xué)過程，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)。

LPS脂多糖激活先天性及適應(yīng)性免疫級(jí)聯(lián)反應(yīng)引發(fā)疾病的機(jī)制（源自文獻(xiàn)：DOI: 10.1111/prd.12433）

研究發(fā)現(xiàn)極低濃度（＜1 ng/mL）的內(nèi)毒素即可刺激白細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子。0.5 ng/mL的內(nèi)毒素處理馬腹膜巨噬細(xì)胞6小時(shí)后，顯著促進(jìn)IL-6表達(dá)。而用10-200 ng/mL的內(nèi)毒素刺激小鼠B細(xì)胞，可誘導(dǎo)免疫球蛋白IgM的表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，1 ng/mL的內(nèi)毒素會(huì)增加大鼠主動(dòng)脈環(huán)中TNF和IL-1的表達(dá)，造成收縮功能受損。同樣濃度的內(nèi)毒素會(huì)提高一氧化氮合酶（NOS）活性，使大鼠心肌細(xì)胞出現(xiàn)收縮功能障礙。

二、內(nèi)毒素控制：藥物研發(fā)的必要前提

內(nèi)毒素誘發(fā)的免疫反應(yīng)不僅威脅候選藥物的安全性和有效性，更會(huì)造成實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)失真，嚴(yán)重干擾抗體藥物的發(fā)現(xiàn)和開發(fā)進(jìn)程。尤其是重組蛋白中存在的內(nèi)毒素，可能會(huì)對(duì)藥物開發(fā)工作產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。

對(duì)動(dòng)物免疫的干擾

在動(dòng)物免疫或體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，內(nèi)毒素引發(fā)的炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物發(fā)生內(nèi)毒素血癥，導(dǎo)致無法進(jìn)行下一步工作，使整個(gè)研究失效。內(nèi)毒素與巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的表面受體TLR4結(jié)合，產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子，并非靶點(diǎn)蛋白誘導(dǎo)，這會(huì)掩蓋抗體藥物的真實(shí)藥效和毒性，會(huì)造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)誤差或誤判，影響后續(xù)臨床劑量設(shè)計(jì)及安全性評(píng)估。

對(duì)體外實(shí)驗(yàn)的干擾

樣品中殘留的內(nèi)毒素可能會(huì)刺激細(xì)胞產(chǎn)生非特異性激活，如誘導(dǎo)凋亡、增強(qiáng)炎癥信號(hào)、細(xì)胞增殖狀態(tài)異常，出現(xiàn)假陽性結(jié)果。這些結(jié)果可能被誤認(rèn)為是抗體藥物的活性，或者掩蓋實(shí)際治療試劑/抗原產(chǎn)生的微妙、特異性的信號(hào)，導(dǎo)致數(shù)據(jù)誤讀，最終對(duì)候選藥物作用機(jī)制得出不準(zhǔn)確的結(jié)論。

交叉污染風(fēng)險(xiǎn)

內(nèi)毒素可吸附在多種實(shí)驗(yàn)材料表面，如離心管、層析樹脂、玻璃容器等，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)間出現(xiàn)交叉污染。

三、內(nèi)毒素控制的策略

在抗體藥物研發(fā)或生物制品生產(chǎn)中，原料、原輔材料、培養(yǎng)基、生產(chǎn)環(huán)境、設(shè)備及器械等，都可能成為內(nèi)毒素的來源。因此控制內(nèi)毒素污染的關(guān)鍵措施是對(duì)產(chǎn)品生產(chǎn)全過程進(jìn)行控制。比如對(duì)設(shè)備、管路實(shí)行在位清洗（CIP）或在位滅菌（SIP），使用無內(nèi)毒素的緩沖液、注射用水及低內(nèi)毒素吸附塑料器皿。嚴(yán)格按照GMP要求進(jìn)行生產(chǎn)，嚴(yán)格無菌操作。

內(nèi)毒素耐熱、耐酸堿。常規(guī)濕熱滅菌法（121℃）不能破壞內(nèi)毒素，有效的方法是滅菌法。一般為180℃ 3-4h、200℃ 60min或250℃ 30-40min。或用強(qiáng)堿強(qiáng)酸滅活內(nèi)毒素，0.2M NaOH或HCl浸泡4h以上。

四、超低內(nèi)毒素蛋白在生物制藥中的關(guān)鍵作用

重組蛋白是生物醫(yī)學(xué)研究和藥物開發(fā)過程中不可或缺的基礎(chǔ)工具，廣泛應(yīng)用于藥物功能研究、機(jī)制分析、抗體發(fā)現(xiàn)和動(dòng)物免疫等關(guān)鍵環(huán)節(jié)。內(nèi)毒素含量是重組蛋白的重要質(zhì)量控制指標(biāo)之一。即使痕量內(nèi)毒素殘留，也可能觸發(fā)免疫反應(yīng)，干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)偏差。

多項(xiàng)研究已正式內(nèi)毒素對(duì)免疫細(xì)胞具有極高的生物學(xué)敏感性。例如，Ratthakorn團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)，極低濃度LPS（0.0025 ng/mL和0.005 ng/mL）即可分別誘導(dǎo)單核細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α和IL-6。這一結(jié)果顯示，在涉及單核細(xì)胞的研究中，即便是極低水平的內(nèi)毒素污染也可能誘發(fā)細(xì)胞因子釋放。因此，用于免疫功能研究的重組蛋白必須采用高靈敏度方法檢測內(nèi)毒素殘留，并確保其處于低于定量限的水平。超低內(nèi)毒素重組蛋白的應(yīng)用，對(duì)于降低實(shí)驗(yàn)背景噪音、提高數(shù)據(jù)可信度以及加速候選藥物的科學(xué)決策，具有重要意義。

極低濃度脂多糖即可誘導(dǎo)單核細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α與IL-6

（源自文獻(xiàn)： doi：10.1186/s13104-022-05941-4）

義翹神州ProPure™超低內(nèi)毒素蛋白及定制服務(wù)

義翹神州位于德克薩斯州的生物工程中心（C4B）采用先進(jìn)的技術(shù)和設(shè)備生產(chǎn)ProPure™超低內(nèi)毒素蛋白，內(nèi)毒素水平低于定量限（BQL）（< 0.05 EU/mg），顯著優(yōu)于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（USP <85>：0.5 EU/mg），適用于臨床前動(dòng)物研究、嚴(yán)格的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)與高敏檢測分析。同時(shí)，C4B還提供超低內(nèi)毒素蛋白定制服務(wù)，滿足臨床前和藥物開發(fā)中對(duì)內(nèi)毒素控制的更高標(biāo)準(zhǔn)需求。

超低內(nèi)毒素蛋白產(chǎn)品列表（熱門靶點(diǎn)）

參考文獻(xiàn)：

Pirkko J. Pussinen, et al. Periodontitis and cardiometabolic disorders: The role of lipopolysaccharide and endotoxemia. Periodontology 2000. DOI: 10.1111/prd.12433

Ratthakorn Chaiwut and Watchara Kasinrerk. Very low concentration of lipopolysaccharide can induce the production of various cytokines and chemokines in human primary monocytes. BMC Research Notes, 2022. https://doi.org/10.1186/s13104-022-05941-4