引 言
Vi-CELL BLU細胞計數(shù)儀能夠?qū)崿F(xiàn)自動地細胞計數(shù)和細胞活率分析。樣品可以通過24位轉(zhuǎn)盤或96孔板進行加載，在快速檢測模式下，僅需170uL樣品體積即可確定細胞計數(shù)、密度和活率。該儀器將樣品的制備、分析和運行后清潔過程實現(xiàn)自動化，使其易于使用，同時還能提供用戶可信賴的分析結果。在本應用短文中，我們展示了Vi-CELL BLU在整個濃度檢測范圍（從50,000到15,000,000個細胞/mL）內(nèi)的線性關系。為此，我們使用校準質(zhì)控微球?qū)υO備的性能進行了測試。此后，我們準備了培養(yǎng)的CHO細胞稀釋系列，以驗證該儀器對活細胞的檢測效果。
濃度質(zhì)控微球
首先，按照相應手冊中的描述，使用Vi-CELL BLU細胞計數(shù)儀測量了幾種質(zhì)控品（表1）。在分析過程中，選擇細胞類型BCI Conc Beads，Dilution選1和常規(guī)檢測模式。
表1：質(zhì)控品
每種質(zhì)控品均測量8支，測量的平均總細胞密度 (TCD) 如圖1所示。4 M和10 M濃度質(zhì)控品的測量值略高于預期的TCD，但所有測量值均在可接受的10%范圍內(nèi)。所有質(zhì)控品的變異系數(shù) (CV) 均低于 5%。通過 Excel 進行線性回歸分析，得到的決定系數(shù) (R2) 為 0.9999，顯示出極佳的線性關系。
圖1：使用Vi-CELL BLU分析0.5 M、4 M和10 M濃度質(zhì)控品。趨勢線通過 (0;0) 擬合。紅色條表示所用質(zhì)控品的可接受范圍。由于所有樣本的CV值較低，垂直誤差條幾乎不可見
CHO細胞稀釋系列的制備
接下來，制備了一個CHO細胞稀釋系列，以驗證在Vi-CELL BLU整個細胞密度測量范圍內(nèi)，使用活的CHO細胞時濃度質(zhì)控品所表現(xiàn)出的線性關系是否依然成立。這里使用的是Rentschler Biopharma SE提供的IgG1生產(chǎn)細胞系的CHO懸浮細胞 (Rehberger et al.，2013) 。
首先，將細胞在37 ℃、180 rpm（25 mm軌道振蕩直徑）的條件下，培養(yǎng)于50 mL PowerCHO培養(yǎng)基 (Lonza) 中，培養(yǎng)基中添加了L-谷氨酰胺和PenStrep（均為Carl RothGmbH+Co.KG），最終濃度為2 mM L-谷氨酰胺、100 I.U./mL青霉素和100 μg/L鏈霉素。
細胞在總細胞密度 (TCD) 達到4.21×10?個細胞/mL、活率為97.08%時被收獲，并通過180 rpm離心5分鐘進行沉淀。
將沉淀用13.3 mL新鮮的PowerCHO培養(yǎng)基重新懸浮，得到的總細胞密度為18.05×10?個細胞/mL（使用Vi-CELL BLU細胞計數(shù)儀測量的10個重復樣本的平均值）。
將得到的細胞懸浮液用于建立一個包含9種不同細胞密度的稀釋系列，范圍從0.03×10?到18.05×10?個細胞/mL（表2）。
表2：CHO細胞稀釋系列。除18.05×10?個細胞/mL外，所有密度均為根據(jù)起始懸浮液的總細胞密度 (TCD) 和稀釋倍數(shù)計算得出的密度
CHO細胞的測量
隨后，使用Vi-CELL BLU細胞計數(shù)儀在常規(guī)檢測模式下（200 μL樣品體積），將所有細胞密度的樣品加載到24位轉(zhuǎn)盤中進行測量，并采用表3中描述的定制化細胞類型設置。每種密度測量了10個重復樣本。
表3：測量CHO細胞稀釋系列的細胞類型設置
細胞計數(shù)分析
最后，收集并分析了所有數(shù)據(jù)。每個稀釋度的平均總細胞密度 (TCD) 和變異系數(shù)如表4所示。
表4：稀釋系列的平均總細胞密度 (TCD) 和變異系數(shù)
這些數(shù)據(jù)的圖形化展示見圖2。根據(jù)移液管的準確性，計算了水平誤差條，并添加了垂直誤差條以表示重復樣本的標準偏差。
圖2：Vi-CELL BLU細胞計數(shù)儀從0.03×10?到18.05×10?個細胞/mL的結果，每個稀釋度10個重復。水平誤差條表示稀釋的不確定性，垂直誤差條顯示標準偏差。線性回歸曲線被強制通過 (0;0)
圖2中的數(shù)據(jù)顯示了在整個范圍內(nèi)極佳的線性關系 (R2=0.9997) 。這證實了Vi-CELL BLU細胞計數(shù)儀在整個濃度范圍（0.05×10?到15×10?個細胞/mL）內(nèi)提供了極佳的線性關系。
通常，較低的細胞密度更容易受到測量不確定性的干擾，因為每張圖像中的細胞計數(shù)總數(shù)較少。圖3展示了一個細胞計數(shù)儀在低細胞密度下更深入地性能分析。在這里，僅顯示了較低的六個數(shù)據(jù)點，密度范圍從0.03×10?到1.20×10?個細胞/mL。
圖3：Vi-CELL BLU細胞計數(shù)儀從0.03×10?到1.20×10?個細胞/mL的結果，每個稀釋度10個重復。水平誤差條表示稀釋的不確定性；垂直誤差條顯示標準偏差。線性回歸曲線被強制通過 (0;0)
再次看到極佳的線性關系 (R2=0.9998) ，證明了該Vi-CELL BLU細胞計數(shù)儀能夠準確區(qū)分低密度細胞樣本。在Vi-CELL BLU細胞計數(shù)儀的濃度測量范圍內(nèi)，所有樣本的變異系數(shù)均低于10%，顯示出該儀器的精確性——即使在低細胞密度下也是如此。
參考文獻：
1. Beckman Coulter Life Sciences. (2019). Cell Counting Performance of Vi-CELL BLU Cell Viability Analyzer. (PART-5060APP03.19).
2. Rehberger, B., Wodarczyk, C., Reichenb?cher, B., K?hler, J., Weber, R., & Müller, D. (2013). Accelerating stable recombinant cell line development by targeted integration. BMC Proceedings, 7(S6), P111. doi:10.1186/1753-6561-7-s6-p111
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