可調(diào)光束直徑和匹配的焦點(diǎn)位置，適用于多達(dá)四種紅外（IR）波長(zhǎng)
多光子顯微鏡是生命科學(xué)研究中的熱門話題之一。公司推出的 STELLARIS DIVE 展示了一系列有益的創(chuàng)新，包括一個(gè)自由可調(diào)的非掃描探測(cè)器和一個(gè)巧妙的光束操控裝置 VBE（可變光束擴(kuò)展器）。該裝置能夠同時(shí)對(duì)多達(dá)四個(gè)紅外光束的光束直徑和軸向紅外校正進(jìn)行自由調(diào)節(jié)。
1931 年，瑪麗亞·戈佩特-梅耶在其博士論文中提出，通過同時(shí)吸收兩個(gè)能量為激發(fā)所需能量一半的光子，可以激發(fā)一個(gè)電子系統(tǒng)[1]。例如，如果某種染料可以在 450 納米處被激發(fā)，那么在約 900 納米處也應(yīng)可以被激發(fā)。這里的關(guān)鍵是“同時(shí)”，即第二個(gè)光子必須在第一個(gè)光子仍在該位置時(shí)到達(dá)可激發(fā)點(diǎn)。這種現(xiàn)象只有在光子的空間和時(shí)間“濃度”非常高，即在非常高的光強(qiáng)下才能實(shí)現(xiàn)。
當(dāng)用高強(qiáng)度紅外（IR）激光照射時(shí)，可以在物鏡的焦點(diǎn)體積中產(chǎn)生高密度的紅外光。為了獲得二維圖像，焦點(diǎn)必須在顯微鏡視野中掃描?？屏帧ぶx帕德首次描述了這種用于非線性照明的掃描顯微鏡[2]。A. Diaspro 則對(duì)該領(lǐng)域的掃描共聚焦和多光子顯微鏡進(jìn)行了全面綜述。[3]
為什么要花錢購(gòu)買復(fù)雜的掃描顯微鏡和昂貴的IR激光器，如果簡(jiǎn)單的熒光顯微鏡就能獲得熒光圖像？多光子激發(fā)提供了兩個(gè)顯著的好處：
內(nèi)在光學(xué)切片：
雙光子激發(fā)熒光依賴于強(qiáng)度的平方，只有在焦點(diǎn)體積內(nèi)才具有足夠的強(qiáng)度。因此，只有在此處的分子才會(huì)被激發(fā)并通過熒光發(fā)射。
深層照明：
生物樣本是渾濁的，會(huì)導(dǎo)致瑞利散射，其散射強(qiáng)度與波長(zhǎng)的四次方成反比。當(dāng)照明波長(zhǎng)加倍時(shí)，瑞利散射的損失減少到 1/16。盡管熒光光的后續(xù)發(fā)射和/或高次諧波仍會(huì)經(jīng)歷強(qiáng)散射，但這種特性使得多光子顯微鏡能夠深入組織內(nèi)部進(jìn)行成像。
由于該方法采用點(diǎn)掃描顯微鏡，多光子激發(fā)系統(tǒng)通常建立在共聚焦束掃描顯微鏡的平臺(tái)上。基本的修改是安裝高強(qiáng)度脈沖IR激光器。
顯微鏡的主要目標(biāo)是提供高光學(xué)分辨率的放大圖像。放大是為了將圖像適配于人眼的分辨率，而高分辨率則用于揭示被研究對(duì)象的細(xì)節(jié)。光學(xué)分辨率主要由光的波長(zhǎng)（顏色）和物鏡的數(shù)值孔徑?jīng)Q定。當(dāng)光學(xué)設(shè)備能夠分辨兩個(gè)相距 d 的物體時(shí)，理論極限被定義為：dA = λ/2NA。
這個(gè)公式類似于恩斯特·阿貝的理論[4][5]，由下標(biāo) A 指出。根據(jù)方法和前提條件，理論極限是不同的，但總是與阿貝公式相差不遠(yuǎn)。（有關(guān)簡(jiǎn)要比較，請(qǐng)參閱作者的另一份報(bào)告[6]）。
這個(gè)極限要求照明在物鏡的后焦平面上均勻分布。這個(gè)要求意味著強(qiáng)度是均勻的：在每個(gè)瞳孔平面上的每一點(diǎn)具有相同的亮度（圖 1）。
激光束的強(qiáng)度（橫截面束寬）并不均勻。它更像是一個(gè)二維高斯分布（在最佳情況下）（圖 1a）。為了確保均勻照明，激光束通常會(huì)被擴(kuò)展，僅使用內(nèi)部部分。此時(shí)，邊緣的強(qiáng)度殘余下降可以忽略不計(jì)（圖 1，左側(cè)行）。
圖 1：激光束直徑變化的影響 a) 激光束的強(qiáng)度分布 I，呈現(xiàn)高斯徑向分布。通過光學(xué)改變束直徑，形狀保持不變，但最大強(qiáng)度可能增加（較小的束直徑，右側(cè)）或減少（較寬的直徑，左側(cè)）?？偰芰坎蛔?。b) 左側(cè)：為了獲得完整的分辨率，后焦平面 P（瞳孔）處的強(qiáng)度分布應(yīng)為平坦。通過用寬束直徑“過填充”瞳孔來實(shí)現(xiàn)這種均勻性。物鏡 L 將光聚焦到焦平面上的樣品 S。右側(cè)：為了產(chǎn)生足夠的雙光子激發(fā)熒光，可以使用較小的束直徑，以避免切割激發(fā)能量。此時(shí)，瞳孔處的強(qiáng)度分布不平坦，而是邊緣較暗，對(duì)應(yīng)于虛擬較小的數(shù)值孔徑。c) 焦點(diǎn)體積由波長(zhǎng)（顏色）和數(shù)值孔徑?jīng)Q定。為了獲得完整的分辨率，較寬的束產(chǎn)生較小的體積（左側(cè)），對(duì)應(yīng)于在 x、y 和 z 方向上的更高分辨率。能量可能較少，從而產(chǎn)生相應(yīng)較少的熒光發(fā)射（綠色）。更窄的光束可以激發(fā)更強(qiáng)烈的熒光（右側(cè)），但與更大的聚焦體積相關(guān)，因此分辨率降低?？梢杂?jì)算出一個(gè)特定的光束直徑，以實(shí)現(xiàn)最佳能量和分辨率。
然而，這種對(duì)光束的操控造成了一個(gè)技術(shù)困境：為了獲得最高分辨率，強(qiáng)度必須均勻，但為了在樣品內(nèi)部獲得最佳的多光子激發(fā)，我們需要盡可能高的強(qiáng)度，不能切去激光束橫截面的重要部分 [7]。實(shí)際的解決方案是一個(gè)可變光束擴(kuò)展器（VBE），允許用戶根據(jù)給定實(shí)驗(yàn)任務(wù)決定哪個(gè)參數(shù)最重要，并相應(yīng)地調(diào)整光束直徑（圖 1）。最佳光束直徑取決于瞳孔的大小，應(yīng)相應(yīng)調(diào)整。
的 VBE 是一種可調(diào)光學(xué)光束擴(kuò)展器，允許用戶在廣泛范圍內(nèi)調(diào)節(jié)照明光束直徑，以滿足分辨率和穿透深度的要求。該模塊可以容納多達(dá)四個(gè)獨(dú)立的可變光束擴(kuò)展光學(xué)元件，能夠同時(shí)對(duì)多達(dá)四種不同的紅外波長(zhǎng)進(jìn)行單獨(dú)控制。
由于折射的波長(zhǎng)依賴性，不同顏色的光線在通過聚光透鏡時(shí)會(huì)顯示出不同的焦點(diǎn)位置，這種現(xiàn)象被稱為軸向色差。在可見光譜范圍內(nèi)（400 至 700 納米），顯微鏡和相機(jī)的光學(xué)透鏡通過組合具有不同折射特性的透鏡來最小化這種色差。對(duì)于特殊應(yīng)用，還提供了校正到近紫外和近紅外范圍的透鏡。
然而，常見透鏡并未針對(duì)同時(shí)使用多個(gè)紅外波長(zhǎng)進(jìn)行校正。在這里，我們可以利用激光束的單一顏色，通過可變光學(xué)元件來校正激發(fā)焦點(diǎn)。通過引入發(fā)散偏差，焦點(diǎn)可以連續(xù)移動(dòng)并適應(yīng)任何紅外顏色。這一結(jié)果是通過可變光束擴(kuò)展器的設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)的，它提供了兩個(gè)自由度，可以獨(dú)立調(diào)節(jié)光束直徑和焦點(diǎn)位置。
圖 2：通過修改光束特性來校正縱向色差。左：當(dāng)兩束同軸且平行的激光束（兩種IR波長(zhǎng)分別用淺紅色和深紅色表示）正確照射一個(gè)次級(jí)校正透鏡時(shí)，焦點(diǎn)體積可能不重合。這個(gè)色差在下方的深綠色和黃色發(fā)射中得以體現(xiàn)，顯示了焦點(diǎn)區(qū)域的放大草圖。右：通過改變激光束的發(fā)散度，深綠色的焦點(diǎn)體積可以沿軸向移動(dòng)，直到與黃色體積重疊，形成明亮的綠色熒光，顯示出完全重合。這個(gè)操作由小箭頭指示。
通過這種方法，可以確保不同紅外波長(zhǎng)的光束聚焦在同一位置，這對(duì)于多色紅外激發(fā)至關(guān)重要，以確保所有圖像在 z 方向上對(duì)齊。
VBE 提供多達(dá)四種不同紅外照明波長(zhǎng)的光束整形，所有紅外光束都可以獨(dú)立調(diào)節(jié)分辨率和穿透深度，并進(jìn)行焦點(diǎn)校正，確保不同紅外顏色激發(fā)的完美重合。
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