在我們探索EV功能的時候，最基礎的3個參數(shù)就是EV樣品的濃度，粒徑和分型。

我們以從健康供體中分離的PPP（去血小板血漿）EV分群為例。3mL全血在200xg下離心5分鐘。從頂部取出1mL血漿，并通過200nm注射器過濾。使用70nm尺寸排阻柱（SEC）純化PPP。篩選出的組分用于單色染色和多色染色進行免疫分型。然后用以下抗體對選定的PPP組分進行染色：CD81 PB、CD9 FITC、CD63 APC、CD61 PC7和CD235a PE。在CytoFLEX納米流式細胞儀上采集樣本，并在CytExpert nano中進行分析。

檢測EV樣本時，樣品清潔度至關重要，因此在檢測前需要確保儀器的背景噪聲足夠低。CytoFLEX nano自帶Baseline檢測功能，可以自動檢查鞘液并基于滿足QC要求的預設閾值，自動監(jiān)測并分析背景信號，快速評估儀器清潔度。在運行實驗的同時，Baseline檢測功能也可以即時檢查儀器和緩沖液清潔度，保證樣品間攜帶污染率小于1%。

在上樣前，選擇合適的樣品濃度至關重要，以避免出現(xiàn)swarm現(xiàn)象。我們通過EPS（<6000 eps）、100%事件處理和避免粘連體，MdFI等維度，選擇適合的樣品稀釋比例。

在獲取檢測數(shù)據(jù)后，我們按照以下設門策略進行數(shù)據(jù)分析：

1. Gate on Singlets 

2. Gate out CD235+ (possible aggregates) 

3. From CD235-, identify CD61+ (Platelet-originated EVs) and CD61- 

4. Further identify CD9+ and CD9- The last plots help to identify CD81+ and CD63+ from these subpopulation

CytoFLEX nano 納米流式分析儀使研究人員能夠清晰檢測血漿來源的EV。該分析儀可準確檢測和區(qū)分單個PPP EV顆粒（包括PB、FITC、PE、APC和PC7） 上的多個熒光通道中的信號，便于用戶監(jiān)測低表達的稀有陽性亞群（如CD63和標記紅細胞污染的CD235a）。

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