隨著采集速度更快、靈敏度更高的質(zhì)譜儀產(chǎn)品的相繼問世，蛋白質(zhì)組學(xué)已躍升為引領(lǐng)學(xué)術(shù)探索和工業(yè)研究多個應(yīng)用領(lǐng)域的重要工具。

隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究的不斷深入以及樣品分析日益常態(tài)化，對標(biāo)準(zhǔn)化和可擴(kuò)展解決方案的需求愈發(fā)迫切。為了滿足這一需求，我們專門為Biomek i5自動化移液工作站量身打造了四項全新升級的全自動工作流程。這些流程與 Evosep 技術(shù)無縫集成，可確保高效、可重復(fù)的端到端樣品制備。Biomek i5自動化移液工作站可并行處理多達(dá)6塊孔板，單次運行可輕松處理576份樣品，并且樣品可自動加載至Evotips進(jìn)行分析。該過程顯著縮短了上樣時間，6塊板的消化酶解過程僅需3小時，過夜消化僅需18小時。

該工作流程采用原裝密封專用適配器，可在 Evotip 上實現(xiàn)樣品自動脫鹽和上樣，以便在下游 LC-MS 分析前高效儲存樣品。

PAC（蛋白聚集捕獲）¹消化酶解工作流程，利用蛋白在磁珠表面的聚集，直接在磁珠上消化還原和烷基化蛋白質(zhì)裂解物。

該工作流程將還原與烷基化步驟相結(jié)合，利用 PAC 消化酶解作為大隊列血漿樣品的簡化處理方法。

Mag-Net（富集）²工作流程將膜結(jié)合囊泡的富集與 PAC消化酶解過程全面結(jié)合，有利于血漿蛋白質(zhì)組學(xué)的深度研究。

首先，將 HeLa細(xì)胞在含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，隨后加入5%的SDS緩沖溶液煮沸收獲。實驗過程中，采用了搭載300μl的多通道移液頭的Biomek i5 MC（）自動化移液工作站、BioShake（D30-T elm, Q-Instruments）和Magnum FLX 磁力載架（Alpaqua）。

進(jìn)行 PAC 消化酶解時，將1μg HeLa裂解物與5μl MagReSyn羥基磁珠（Resyn Biosciences）混合。將異丙醇添加至80%的濃度并在BioShake模塊上混勻。蛋白結(jié)合在磁珠上后，用異丙醇進(jìn)行一次洗滌，之后，在 37°C 或環(huán)境溫度（板間變異實驗）下用 40ng 胰蛋白酶（T6567, Sigma Aldrich）和 10ng Lys-C（129-02541, Wako Fujifilm）進(jìn)行過夜（16小時）消化酶解。將樣品稀釋至適當(dāng)濃度，然后再上樣至Evotips。

血漿按照早期檢測研究網(wǎng)絡(luò)（EDRN）規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)操作流程³進(jìn)行提取。進(jìn)行純血漿分析時，在稀釋之前將 1 μl 血漿進(jìn)行裂解、還原和烷基化，并使用約2 μg蛋白進(jìn)行消化酶解。之后加入5 μl羥基磁珠開始PAC消化酶解步驟。消化酶解后，將所得肽段的40%上樣至 Evotips。進(jìn)行Mag-Net富集時，將4 μl血漿與磁珠結(jié)合緩沖液和1 μl MagReSyn SAX磁珠（ReSyn Biosciences）按1:1比例混合。隨后在三次洗滌以及一鍋法裂解、還原和烷基化步驟后，如上所述步驟進(jìn)行 PAC 消化酶解。在37°C下過夜消化酶解后，將所得肽段的80%上樣至Evotips。

該工作流程旨在實現(xiàn)高效且具成本效益的大隊列樣本分析。將 Evotip 上樣作為每個工作流程的最后步驟，樣品將安全儲存至 Evotip Pure，直至完成 LC-MS 分析。這種方法通過僅消化所分析的內(nèi)容，利用和分析接近100%的消化樣品，通過減少酶和樣品消耗來最大限度地降低每個樣品的成本。此外，該工作流程使用單一樣品專用吸頭和共用移液吸頭，可確保高通量樣品制備的持續(xù)運行。采用孵育步驟以交叉方式處理多個96孔板，顯著提高了整體實驗通量。因此，當(dāng)同時處理6塊每塊內(nèi)含96份樣品的孔板時，每個工作流程中每份樣品的總處理時長不到 2 分鐘，總共僅需 18小時的處理時間。

采用 500 SPD 方法分析板間變異樣品，并采用 200 SPD 方法分析所有其他樣品。EV1107 色譜柱（Evosep）在室溫下操作，用于在 timsTOF HT 質(zhì)譜儀（Bruker）上進(jìn)行的所有實驗，默認(rèn)采用“短梯度直徑-PASEF MS 方法”。使用無庫模式的 DIA-NN（版本 1.8.1）與人類蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫（Uniprot，2020 年 10 月，20,600 個無亞型條目）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，胰蛋白酶/P作為蛋白酶，允許2次遺漏切割。分析時，對所有條件進(jìn)行單獨搜索，并在同一條件下進(jìn)行的重復(fù)實驗啟用運行間匹配。

圖 1：Biomek i5 自動化移液工作站臺面布局圖以及基于每個工作流程處理 1-6 塊板時每份樣品所花費時間的通量示意圖。

利用 Bioshake 振蕩模塊在 37 °C下過夜消化酶解，以確保最佳消化酶解效果，并使用密封蓋密封以防止樣品蒸發(fā)，并獲得實驗數(shù)據(jù)。該實驗同樣適用更短的消化酶解時間。我們處理了一個具有兩種不同 HeLa起始量和兩種空白類型的樣品板，結(jié)果發(fā)現(xiàn)未出現(xiàn)交叉殘留污染，這一點可通過空白中忽略不計的信號強(qiáng)度加以證明。在 timsTOF HT上使用200 SPD方法進(jìn)行質(zhì)譜分析，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)上樣量為1 μg時，我們從每份樣品中鑒定出5,500個蛋白質(zhì)，上樣量為500 ng時，鑒定出4,900 個蛋白。

當(dāng)處理6塊上樣量為1 μg HeLa的孔板時，未出現(xiàn)板間變異，蛋白質(zhì)水平的高 Pearson 相關(guān)系數(shù)證明了這一點。此外，我們還觀察到高效、可重復(fù)的消化酶解過程，以及在所有工作流程中，蛋白水平中位變異系數(shù)（CV）均低于 20%。Evosep技術(shù)與Biomek i5自動化移液工作站的全面整合，無縫集成了可擴(kuò)展的樣品制備和 LC-MS 分析工作流程，確保獲得可重復(fù)的高質(zhì)量結(jié)果。

圖 2：PAC HeLa 板（80% 上樣和 200 SPD 法）的總信號強(qiáng)度和 6 塊板（40% 上樣和 500 SPD 法）的蛋白 Pearson 相關(guān)系數(shù)熱圖。采用 200 SPD 法分析的工作流程的消化酶解效率和蛋白組 CV。

非靶向血漿蛋白質(zhì)組學(xué)在監(jiān)測疾病發(fā)生和進(jìn)展相關(guān)的臨床研究中應(yīng)用前景巨大。Evosep配備移液吸頭形式的一次性捕獲柱，是處理血漿等具有挑戰(zhàn)性的樣品類型的理想平臺。因此，本文所描述的純血漿分析和Mag-Net富集工作流程，可為大規(guī)模生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用提供強(qiáng)大的分析利器。

為了證明工作流程的有效性，我們使用1 μl血漿制備了40份純血漿樣品，并使用4 μl血漿初始量制備了40份Mag-Net 富集樣品。純血漿分析表現(xiàn)出出色的分析深度，采用標(biāo)準(zhǔn)200 SPD方法鑒別出500種蛋白。

Mag-Net富集分析成功壓縮了動態(tài)范圍，采用200 SPD方法鑒別出2,700種蛋白，是純血漿分析蛋白鑒別數(shù)量的 5 倍以上。在已鑒別的蛋白中，有40 種已在Vesiclepedia數(shù)據(jù)庫中列出，其中多數(shù)蛋白CV 均低于20%，驗證了該工作流程的有效性。最后，我們分別選擇了一種高豐度血漿蛋白（ALB）、一種 EV 標(biāo)志物（CD63）和一種已知的癌癥生物標(biāo)志物（ALDOA），并繪制了這三種樣品在兩種分析條件下所有40次重復(fù)的豐度。重復(fù)結(jié)果間的高度相似性表明，全面集成解決方案可跨重復(fù)的工作流程實現(xiàn)穩(wěn)健可靠的實驗結(jié)果。

圖 3：純血漿（1 μl，40% 上樣）和 Mag-Net 血漿（4 μl，80% 上樣）的動態(tài)范圍。蛋白組 CV 與豐度以及豐度與所選蛋白分布的散點圖。采用 200 SPD 法分析樣品。

Biomek i5 自動化移液工作站與 Evosep 技術(shù)的完美融合，為高通量蛋白質(zhì)組學(xué)分析領(lǐng)域帶來了前所未有的強(qiáng)大且靈活的解決方案。我們的自動上樣、PAC 消化酶解、純血漿分析和 Mag-Net 富集分析等自動化工作流程，充分展現(xiàn)了其卓越的實驗通量、重現(xiàn)性和分析深度。這些自動化工作流程極大減少了人工干預(yù)，大幅降低了成本，幫助用戶輕松處理同類樣本的大隊列研究，因而成為常規(guī)分析和大規(guī)模研究的首選平臺。通過將尖端自動化技術(shù)與液相色譜技術(shù)的全面融合，我們的解決方案充分滿足了市場對標(biāo)準(zhǔn)化和可擴(kuò)展蛋白質(zhì)組學(xué)方案日益增長的需求。這些方案為臨床研究和工業(yè)應(yīng)用中追求高質(zhì)量蛋白質(zhì)組學(xué)研究的客戶，開辟了一條更加寬廣的科研道路。

Biomek 自動化移液工作站和Evosep One 儀器僅供研究使用，不用于臨床診斷。

參考文獻(xiàn)

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