微藻滿足飲食需求的潛力引起了食品行業(yè)的關(guān)注。根據(jù)歐洲食品安全局（EFSA）的數(shù)據(jù)，消費者對天然食用色素的需求正在增加，他們更喜歡天然產(chǎn)品，而不是可能有潛在毒性的合成食品添加劑1。然而，天然色素可能對光照敏感，當(dāng)暴露在不同的環(huán)境條件（pH 和溫度）下時會變色；此外，它們的顏色范圍通常有限。所有這些因素都促使人們圍繞用作食品染料的新型天然色素進(jìn)行研發(fā)。
食品工業(yè)中具有獨特特性的微藻色素的發(fā)現(xiàn)，需要高通量自動化的方式，以在更短的時間內(nèi)篩選大量微藻藻株。利用這項技術(shù)，F(xiàn)ermentalg 實驗室利用 Galdieria sulphuraria 的代謝產(chǎn)生了一種富含 C - 藻藍(lán)蛋白的天然藍(lán)色色素，被提取并商業(yè)化為 BLUE ORIGINS?2。
（BLUE ORIGINS? 與其他微藻衍生染料相比，BLUE ORIGINS 是一種天然色素，具有在低 pH 和高溫下的穩(wěn)定性等特性，在食品和飲料行業(yè)有廣泛應(yīng)用，如糖果、飲料和即食谷物等。迄今為止，C - 藻藍(lán)蛋白是 FDA 的食品著色劑豁免產(chǎn)品清單中唯一的藍(lán)色顏料，適用于生產(chǎn)天然產(chǎn)品3。）
Fermentalg 科學(xué)家開發(fā)了一種創(chuàng)新的方法，使用 QPix 420 微生物克隆篩選系統(tǒng)（Molecular Devices）篩選和挑取微藻藻株。傳統(tǒng)上，克隆挑選是使用無菌移液管尖端或接種環(huán)手動進(jìn)行的，這通常是緩慢、勞動密集和耗時的。QPix 420 系統(tǒng)允許高通量克隆挑取，可達(dá) 3000 克隆 / h，挑取效率 >98%。多種熒光通道增加了系統(tǒng)靈活性，能夠根據(jù)熒光蛋白表達(dá)或熒光色素的形態(tài)特征和水平對獨特克隆進(jìn)行表型篩選。
實驗方法
在尋找一種高產(chǎn) C - 藻藍(lán)蛋白的 Galdieria sulphuraria 藻株過程中，F(xiàn)ermentalg 獲得并保存了一組具有不同 C - 藻藍(lán)素含量的變體。首先將藻株接種在 Gross-agar 培養(yǎng)基4（pH 3）上，并在 37°C、60% 濕度環(huán)境中避光培養(yǎng)兩周。然后使用 QPix 420 系統(tǒng)對所有培養(yǎng)板進(jìn)行成像和分析，通過使用圣誕樹形狀的倒鉤型挑針成功地挑取并進(jìn)行接種。通過使用內(nèi)部清洗模塊對針進(jìn)行在線消毒來保持無菌（圖 1）。
（QPix 提供多種形狀和直徑的挑針來確保與不同微生物的兼容性，提高挑取效率。）
圖 1：使用 QPix 的克隆篩選流程
用熒光法篩選 G.sulphuraria 藻株
G.sulphuraria 富含 C - 藻藍(lán)蛋白，一種在藍(lán)綠藻中發(fā)現(xiàn)的水溶性蛋白，呈現(xiàn)特有的亮藍(lán)色。當(dāng)用紅光激發(fā)時，C - 藻藍(lán)蛋白發(fā)射熒光，峰值在 642 nm5。
在透射光和熒光下，QPix 對兩周大的 G.sulphuraria 克隆進(jìn)行成像和篩選，這使得能夠客觀地鑒定和選擇產(chǎn)生 C - 藻藍(lán)蛋白的克隆。首先，通過 QPix Fusion 軟件獲取透射光和所選熒光下的板的測試圖像（圖 2A & B）。
圖 2：A) 微藻 G.sulphuraria 在透射光下的測試圖像。B) 在熒光通道 (Ex/Em濾光片：628/692 nm) 中獲得相同樣品的測試圖像，以檢測表達(dá) C - 藻藍(lán)蛋白的克隆
一旦捕捉到圖像，QPix Fusion 軟件就會根據(jù)特征特性對其進(jìn)行分析，并確定培養(yǎng)板（培養(yǎng)皿、Omnitray 或 QTray）上單個克隆的位置。Fusion 軟件的靈活性允許用戶根據(jù)菌落大小、緊湊度、軸比、直徑和最小臨近度等篩選所需的克隆。因此，基于設(shè)置的參數(shù)，符合的 G.sulphuraria 克隆被包括在內(nèi)（圖 3，黃色），不符合的被排除在外（圖 3、紅色）。
圖 3：符合設(shè)置參數(shù)的被選中，顯示為黃色。不符合設(shè)置參數(shù)的被排除，顯示為紅色。右上角面板：為準(zhǔn)確篩選克隆而設(shè)置的篩選標(biāo)準(zhǔn)。
定量的熒光強度閾值指定了所需的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。為了選擇含有最高濃度 C - 藻藍(lán)蛋白的克隆，需要調(diào)整熒光強度范圍。對于該實驗，選擇產(chǎn)生平均熒光強度（MFI）值在 36000 和 43000 之間的 C - 藻藍(lán)蛋白的克隆（圖 4A & B）。一旦根據(jù)用戶定義的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行選擇，就可以使用 QPix 420 系統(tǒng)準(zhǔn)確地挑取克隆。
圖 4：產(chǎn)生 C - 藻藍(lán)蛋白的 G.sulphuraria 克隆的熒光篩選。A) 表達(dá)不同水平的 C - 藻藍(lán)蛋白的 G.sulphuraria 克隆的代表性熒光圖像，使用紅色熒光通道 (Ex/Em:628/692)。B) 熒光直方圖顯示為選擇的平均強度
高表達(dá) C - 藻藍(lán)蛋白克隆的篩選與檢測
最后，使用 QPix 420 系統(tǒng)分析了產(chǎn)生不同含量 C - 藻藍(lán)蛋白的不同 G.sulphuraria 藻株，以測試 QPix 區(qū)分和選擇高表達(dá) C - 藻藍(lán)素克隆的能力，這些克隆在視覺上看起來是深綠色的（圖 5A）。正如預(yù)期的那樣，具有低濃度的 C - 藻藍(lán)蛋白的克隆在瓊脂平板上呈現(xiàn)白色，而表達(dá)平均水平的克隆呈現(xiàn)淺綠色。因此，用 QPix 420 在透射光中對不同克隆進(jìn)行成像，然后基于 C - 藻藍(lán)蛋白熒光強度進(jìn)行篩選（圖 5B & C）。檢測到深綠色和淺綠色菌落的熒光信號。特別地，基于先前設(shè)置的 36000 至 43000 的平均熒光強度值，成功地選擇和挑選了深綠色克隆。最后，熒光成像中白色克隆的消失證實了這些克隆中不存在 C - 藻藍(lán)蛋白。
圖 5：高表達(dá) C - 藻藍(lán)蛋白克隆的篩選。A) 對具有不同色素沉著的 G.sulphuraria 克隆進(jìn)行了分析。B) 用 QPix 420 相機檢測到的同一克隆板的透射光 (TL) 圖像。C) G.sulphuraria 克隆的熒光圖像（紅色熒光通道，Ex/Em:628/692nm），被選擇的克隆顯示為黃色，被排除的克隆顯示紅色
總結(jié)
由于對天然和可持續(xù)食品成分的需求增加，食品行業(yè)對微藻的興趣正在上升。Fermentalg 正在利用微藻代謝來開發(fā)和篩選多種能產(chǎn)生低 pH 值和高溫穩(wěn)定的天然藍(lán)色色素作為食品成分的 G.sulphuraria 藻株（BLUE ORIGINS）。為了加速該產(chǎn)品的工業(yè)應(yīng)用，進(jìn)行了 G.sulphuraria 藻株克隆的自動化篩選。與傳統(tǒng)篩選方法相比，高通量克隆篩選具有顯著優(yōu)勢，包括更快地鑒定所需克隆，從而簡化后續(xù)的下游分析。
QPix 熒光能力用于選擇產(chǎn)生更高濃度 C - 藻藍(lán)蛋白的克隆，從而加快了基于微藻的天然色素生產(chǎn)的規(guī)模?？傊咄孔詣踊瘜ξ⒃瀹a(chǎn)品的未來發(fā)展前景廣闊。
QPix 420 微生物克隆篩選系統(tǒng)
參考文獻(xiàn)
1. Carocho M, et al. Adding Molecules to Food, Pros and Cons: A Review on Synthetic and Natural Food Additives. Compr Rev Food Sci Food Saf. 2014 Jul;13(4):377-399. doi: 10.1111/1541-4337.12065. PMID: 33412697
2. Athane et al., The safety evaluation of phycocyanin-enriched Galdieria sulphuraria extract using 90-day toxicity study in rats and in vitro genotoxicity studies. Toxicology Research and Application 2020.
3. Minxi Wan et al., Comparison of C-phycocyanin from extremophilic Galdieria sulphuraria and Spirulina platensis on stability and antioxidant capacity, Algal Research 2021, Volume 58.
4. Gross, W. & Schnarrenberger, C. (1995): Heterotrophic growth of two strains of the acido-thermophilic red alga Galdieria sulphuraria. Plant Cell Physiol. 36(4): 633-638.
5. Niels T. Eriksen, Production of phycocyanin—a pigment with applications in biology, biotechnology, foods and medicine. Applied Microbiology and Biotechnology, 2008.
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Molecular Devices 始創(chuàng)于上世紀(jì) 80 年代美國硅谷，并在全球設(shè)有多個代表處和子公司。2005 年，Molecular Devices 在上海設(shè)立了中國代表處，2010 年加入全球科學(xué)與技術(shù)的創(chuàng)新者丹納赫集團，2011 年正式成立商務(wù)公司：美谷分子儀器 (上海) 有限公司。Molecular Devices 以持續(xù)創(chuàng)新、快速高效、高性能的產(chǎn)品及完善的售后服務(wù)著稱業(yè)內(nèi)，我們一直致力于為客戶提供在生命科學(xué)研究、制藥及生物治療開發(fā)等領(lǐng)域蛋白和細(xì)胞生物學(xué)的創(chuàng)新性生物分析解決方案。
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