實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）徹底改變了科學(xué)家檢測和定量核酸靶標(biāo)的方式，具有高靈敏度、速度快、可擴(kuò)展性強(qiáng)等優(yōu)勢。許多實(shí)時(shí)PCR實(shí)驗(yàn)在每個(gè)反應(yīng)孔中只檢測一個(gè)靶標(biāo)，這種方式稱為單重qPCR（Singleplex qPCR）。

然而，通過一種稱為多重qPCR（Multiplex qPCR）的方法，可以進(jìn)一步提升實(shí)時(shí)PCR的效率。多重qPCR允許在同一個(gè)反應(yīng)孔中同時(shí)擴(kuò)增并檢測多個(gè)相互獨(dú)立的靶標(biāo)，從而在更少的反應(yīng)次數(shù)中獲得更多數(shù)據(jù)，同時(shí)提高試劑利用率并改善實(shí)驗(yàn)重復(fù)性。

在使用染料法或TaqMan?探針法時(shí)，還包括一個(gè)帶有熒光標(biāo)記的探針，在單重 qPCR實(shí)驗(yàn)中，每個(gè)反應(yīng)孔只擴(kuò)增一個(gè)檢測項(xiàng)目。

在多重qPCR中，則可在同一個(gè)反應(yīng)孔中同時(shí)擴(kuò)增兩個(gè)或多個(gè)靶標(biāo)，每個(gè)靶標(biāo)通過帶有不同熒光染料的探針進(jìn)行區(qū)分。

在現(xiàn)有的化學(xué)體系中，TaqMan探針法非常適合多重qPCR，因?yàn)椋禾结槺旧砭哂懈叨忍禺愋?，每個(gè)探針對應(yīng)獨(dú)立的熒光信號。

這種“雙重優(yōu)勢”使研究人員能夠在一次反應(yīng)中擴(kuò)增多個(gè)檢測項(xiàng)目，并分別對每個(gè)靶標(biāo)進(jìn)行準(zhǔn)確檢測。

與單重qPCR相比，多重qPCR具有顯著優(yōu)勢：更高的通量，每孔檢測更多靶標(biāo)，提高整塊反應(yīng)板的檢測效率，更低的試劑和樣本消耗，更高效地利用昂貴試劑和有限的生物樣本。

更高的精密度與可靠性，同孔內(nèi)的內(nèi)參對實(shí)驗(yàn)波動進(jìn)行歸一化更高的數(shù)據(jù)可信度，與單重qPCR不同，所有靶標(biāo)和內(nèi)控在同一反應(yīng)孔中完成，更具可比性通常，從雙重qPCR（Duplex）開始是一個(gè)現(xiàn)實(shí)可行的第一步。隨著技術(shù)發(fā)展，通過在單個(gè)反應(yīng)中結(jié)合3個(gè)或更多靶標(biāo)，多重qPCR的優(yōu)勢將進(jìn)一步放大。在Thermo Fisher Scientific提供的先進(jìn)工具、服務(wù)和產(chǎn)品支持下，高階多重qPCR（最多6個(gè)靶標(biāo)）已不再遙不可及。

在以下情況下，多重qPCR的價(jià)值尤為突出：需要對大量樣本使用相同的一組檢測項(xiàng)目。

對數(shù)據(jù)質(zhì)量和質(zhì)量控制要求較高，樣本量有限或樣本十分珍貴，如果你的項(xiàng)目需要檢測的靶標(biāo)數(shù)量很多（例如超過12個(gè)），那么使用實(shí)時(shí)PCR芯片陣列（qPCR Array）可能會更加高效。

隨著多重反應(yīng)中靶標(biāo)數(shù)量增加（3–6 個(gè)），實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的復(fù)雜性也會顯著提升。此時(shí)，一些技術(shù)應(yīng)用科學(xué)家（TAS）和現(xiàn)場應(yīng)用科學(xué)家（FAS）可提供專業(yè)指導(dǎo)。

成功的多重qPCR流程需要合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與充分的測試，主要包括以下幾個(gè)方面：

選擇兼容的檢測項(xiàng)目，首先確定你希望組合的檢測項(xiàng)目?？蓪?shí)現(xiàn)的多重?cái)?shù)量取決于儀器的光學(xué)檢測通道數(shù)。例如：如果儀器具備6個(gè)檢測通道，理論上最多可同時(shí)檢測 6個(gè)靶標(biāo)。

可使用qPCR Assay Design Hub中的 Multiplexing Support Request Tool 檢查檢測項(xiàng)目的兼容性。多重支持團(tuán)隊(duì)還可提供免費(fèi)的計(jì)算機(jī)模擬分析，以識別潛在的引物或探針相互干擾問題。

合理的染料選擇有助于實(shí)現(xiàn)清晰的光譜區(qū)分。

推薦使用的染料包括：FAM、VIC ROX、Cy5、Cy5.5、CY3大多數(shù)Applied Biosystems?試劑都包含被動參比染料 ROX?，在多重qPCR中尤為有益。

柏恒科技Q9600系列無需ROX通道可進(jìn)行多重實(shí)驗(yàn)可自由選擇相應(yīng)的染料，無需要進(jìn)行染料校準(zhǔn)。

在單重TaqMan實(shí)驗(yàn)中，通常推薦使用統(tǒng)一的引物濃度（900 nM）。

但在多重反應(yīng)中，如果仍使用該濃度，可能會導(dǎo)致：高豐度靶標(biāo)迅速擴(kuò)增。

Taq DNA聚合酶被“耗盡”或飽和抑制低豐度靶標(biāo)的擴(kuò)增為避免這種情況，可對某些檢測項(xiàng)目采用降低引物濃度的策略。

普通條件下，高豐度靶標(biāo)擴(kuò)增至聚合酶飽和后進(jìn)入線性期低豐度靶標(biāo)也被迫進(jìn)入線性期，Ct值不準(zhǔn)確甚至無法檢測，通過引物限制，使擴(kuò)增因引物耗盡而非聚合酶飽和進(jìn)入線性期，從而保證低豐度靶標(biāo)仍處于指數(shù)擴(kuò)增階段  提供：VIC標(biāo)記、引物限制（PL）格式的基因表達(dá)檢測，定制 TaqMan?基因表達(dá)檢測特殊寡核苷酸合成服務(wù)，可選擇不同染料與PL格式，放大規(guī)模前的性能測試在正式應(yīng)用多重qPCR 之前，必須對其性能進(jìn)行驗(yàn)證。

更嚴(yán)格的方法：混合標(biāo)準(zhǔn)曲線將一個(gè)靶標(biāo)進(jìn)行系列梯度稀釋同時(shí)加入固定量的第二個(gè)靶標(biāo)。在實(shí)時(shí)PCR中擴(kuò)增混合樣本。理想情況下，兩個(gè)靶標(biāo)在整個(gè)檢測范圍內(nèi)都應(yīng)保持良好的線性關(guān)系對于三重或更高階多重反應(yīng)，需要測試多組靶標(biāo)組合。

較簡化的方法：對同一批樣本分別進(jìn)行單重和多重?cái)U(kuò)增比較兩種結(jié)果的一致性將多重檢測整合為單管試劑，如果多重qPCR 的性能驗(yàn)證結(jié)果令人滿意，可使用特殊寡核苷酸將所有檢測項(xiàng)目預(yù)混為單管形式。

其優(yōu)勢包括：簡化實(shí)驗(yàn)配制流程，確保引物和探針比例一致，提高實(shí)驗(yàn)重復(fù)性。

【實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀系列】

杭州柏恒科技有限公司成立于2009年，是一家集研發(fā)、生產(chǎn)、銷售及服務(wù)于一體的國家高新技術(shù)企業(yè)。公司10多年以來一直專注于分子生物實(shí)驗(yàn)室設(shè)備，主營產(chǎn)品有實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，等溫?zé)晒釶CR儀，定性梯度PCR儀，全自動PCR儀，全自動核酸提取儀、酶標(biāo)儀、超微量以及相關(guān)配套產(chǎn)品。