BIO-GENER
在聊qPCR之前依舊是得先聊一下基因?qū)W之父：沃森和克里克。
1953年4月25日，沃森和克里克在Nature雜質(zhì)上發(fā)表了題為“核酸的分子結(jié)構(gòu)”的論文，揭示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)，也因此共同獲得了1962年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。
在這篇論文里摘兩點出來：
雙螺旋結(jié)構(gòu)：DNA是由兩條反向平行的多核苷酸鏈組成，糖和磷酸骨架在外，堿基在內(nèi)，兩條多核苷酸鏈靠堿基之間的氫鍵結(jié)合在一起，整體呈螺旋狀。
堿基互補(bǔ)配對原則：DNA一條多核苷酸鏈上的A，總是與另一條多核苷酸鏈上的T形成氫鍵;而G總是與C形成氫鍵。
理科的朋友們是不是對此圖很是熟悉
再聊qPCR技術(shù)，目前已是分子生物學(xué)研究中一極為常見的檢測手段，簡單概括為在PCR反應(yīng)的過程中通過在退火延伸階段收集熒光信號，實時的檢測PCR反應(yīng)的技術(shù)。熒光信號的來源可以是SYBR Green為代表的染料，也可以是標(biāo)記了熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的水解探針。SYBR Green染料本身在497nm波長的光刺激下僅發(fā)出微弱的熒光，但與雙鏈DNA結(jié)合后，發(fā)射的熒光大大增強(qiáng)，發(fā)射波長約為520nm（對應(yīng)上文的論點1，發(fā)光是基于DNA結(jié)構(gòu)的特異性）。水解探針的熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)在探針結(jié)構(gòu)完整時，在激發(fā)光的照射下不發(fā)出發(fā)射光（發(fā)射光被淬滅基團(tuán)吸收）；探針被水解后（基于堿基互補(bǔ)配對原則，探針結(jié)合在經(jīng)變性的DNA單鏈上，在后續(xù)的擴(kuò)增過程中被Taq酶的外切活性切斷，熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離）熒光基團(tuán)再經(jīng)激發(fā)光照射就可發(fā)出發(fā)射光（對應(yīng)論點2，發(fā)光基于DNA堿基序列的特異性）。不論染料法還是水解探針法，每經(jīng)過一個循環(huán)后信號積累的理論相對量都是一樣的，都是上一個循環(huán)的2倍（基于半保留復(fù)制的機(jī)理）。
qPCR反應(yīng)的前期因為產(chǎn)物量很少，所以積累的熒光有限，不足以被儀器分辨出是否是本底的熒光信號。當(dāng)隨著反應(yīng)的進(jìn)行，熒光信號逐漸積累，熒光信號積累至可與本底信號進(jìn)行明顯的區(qū)分時，此時的熒光強(qiáng)度（縱坐標(biāo)數(shù)值）則稱為閾值，通過閾值的水平橫線為閾值線；擴(kuò)增曲線和閾值線交點的橫坐標(biāo)所代表的生物學(xué)意義是，初始樣本歷經(jīng)多少個循環(huán)反應(yīng)后的熒光（產(chǎn)物）積累達(dá)到儀器能明確區(qū)分的水平（Ct值or Cq值，通過數(shù)值的大小衡量初始模板的多寡）。
qPCR循環(huán)段反應(yīng)，從開始到Ct值，產(chǎn)物信號的積累近似于以每經(jīng)歷一個循環(huán)，信號擴(kuò)大2倍進(jìn)行，這是定量法計算初始濃度的理論基礎(chǔ)，雖然在實際的檢測過程中無法被檢測到。原因是前期（基線期）本底信號強(qiáng)，掩蓋了初始產(chǎn)物信號積累的變化，儀器能明確區(qū)分本底信號與產(chǎn)物信號是在經(jīng)歷過Ct值以后。經(jīng)過Ct值之后，隨著引物、dNTP的被消耗，信號擴(kuò)大會在極短的時間內(nèi)（指數(shù)期）進(jìn)入以不足2倍的速率擴(kuò)增的區(qū)間（線性期）。隨著反應(yīng)的繼續(xù)，引物被近乎耗盡、酶活力降低、反應(yīng)副產(chǎn)物積累等因素影響qPCR反應(yīng)近乎停止，產(chǎn)物基本不在增加，熒光信號的強(qiáng)度也基本維持在一定值（平臺期），如下圖：
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杭州有限公司成立于2009年，是一家集研發(fā)、生產(chǎn)、銷售及服務(wù)于一體的國家高新技術(shù)企業(yè)。公司10多年以來一直專注于分子生物實驗室設(shè)備，主營產(chǎn)品有實時熒光定量PCR儀，等溫?zé)晒釶CR儀，定性梯度PCR儀，全自動PCR儀，全自動核酸提取儀、酶標(biāo)儀、超微量以及相關(guān)配套產(chǎn)品。
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