微流控混合技術(shù)的引入為脂質(zhì)體和脂質(zhì)基納米顆粒的制備打開了新的大門，這些技術(shù)可應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)規(guī)模。本研究證明了磷脂雙層片段作為關(guān)鍵中間體在脂質(zhì)體形成機(jī)制中的作用，該機(jī)制是通過在NanoAssemblr儀器的“魚骨”幾何通道中微流控混合形成的。脂質(zhì)雙層的流動(dòng)性用探針N,N,N-三甲基-4-(6-苯基-1,3,5-己三烯-1-基)的熒光各向異性來表示，發(fā)現(xiàn)它是影響脂質(zhì)和水相的乙醇溶液微流控混合形成的脂質(zhì)體的Z終大小的基本參數(shù)。飽和和不飽和脂質(zhì)以及不同膽固醇含量的脂質(zhì)被用于脂質(zhì)體的制備，并證明了通過DLS分析，流動(dòng)性的增加導(dǎo)致脂質(zhì)體大小的降低。螯合脂質(zhì)被用于CryoTEM觀察脂質(zhì)體和雙層片段的精細(xì)結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論計(jì)算結(jié)果與脂質(zhì)膜膠束泡沫化理論吻合。

脂質(zhì)體，基于脂質(zhì)雙層的自組裝納米顆粒，被廣泛用于生物醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)目的。脂質(zhì)體由一個(gè)或多個(gè)薄片組成，由磷脂雙層和包圍的小體積的水溶液組成。脂質(zhì)體的直徑可以從幾十納米到數(shù)百微米不等，這取決于它們的制備方法。平均大小約為80納米的單層或寡層脂質(zhì)體通常被生產(chǎn)和用于藥物輸送系統(tǒng)。

脂質(zhì)體膜的主要成分磷脂和脂質(zhì)，在各種有機(jī)溶劑中溶解性良好，因此目前大多數(shù)方法使用有機(jī)溶劑(如甲醇、乙醇、叔丁醇、氯仿、醚類)將脂質(zhì)溶解為整個(gè)過程的第一步。如果有機(jī)溶劑與水混溶，脂質(zhì)體可以通過將脂質(zhì)的醇溶液與水相混合來制備。乙醇注射法和前脂質(zhì)體-脂質(zhì)體法是實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)規(guī)模中已建立的技術(shù)。

微流控技術(shù)的出現(xiàn)為脂質(zhì)體和其他脂質(zhì)基納米顆粒的片上制備打開了一扇新的大門。 微流控技術(shù)已經(jīng)證明了其控制有機(jī)相和水相混合過程的能力，因此，Z終脂質(zhì)體產(chǎn)品所需的參數(shù)，如尺寸、多分散性、形態(tài)和層狀結(jié)構(gòu)，可以以更可重復(fù)的方式實(shí)現(xiàn)。

各種系統(tǒng)被設(shè)計(jì)和建造用于實(shí)驗(yàn)室使用，也用于該技術(shù)在工業(yè)規(guī)模上的應(yīng)用。脂質(zhì)體生產(chǎn)的微流體方法是基于各種幾何形狀的混合通道的應(yīng)用以及剪切力、電場或通道中發(fā)生的各種微流體效應(yīng)的應(yīng)用。Carugo et al.8, Wang et al.和MaekiZ近發(fā)表了一篇綜合綜述。描述決定脂質(zhì)雙層圓盤形成脂質(zhì)體的動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)參數(shù)的理論模型被描述。微流體混合過程可以幫助優(yōu)化方法，特別是Z近證明的利用復(fù)雜芯片技術(shù)進(jìn)行工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)的方法。

我們使用具有“魚骨”幾何形狀的微流體混合通道在毫秒和納升反應(yīng)體積內(nèi)進(jìn)行納米沉淀?；旌贤ǖ赖摹棒~骨”幾何形狀將此過程與基于微流體水動(dòng)力流動(dòng)聚焦的微流體混合過程區(qū)分開來，后者是通過兩個(gè)水緩沖液流來聚焦酒精流。

目前，“魚骨”幾何混合通道已經(jīng)作為商業(yè)產(chǎn)品與計(jì)算機(jī)控制儀器一起用于脂質(zhì)和聚合物納米顆粒的實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)規(guī)模制備。因此，該方法可廣泛用于制備納米脂質(zhì)體。在魚骨通道中進(jìn)行微流控混合制備脂質(zhì)體的示意圖如圖1所示。

在本研究中，我們應(yīng)用螯合脂質(zhì)和冷凍電子透射顯微鏡來詳細(xì)觀察脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)、脂質(zhì)體膜和整個(gè)過程中形成的中間體。我們測試了脂質(zhì)膜流動(dòng)性對脂質(zhì)體Z終形態(tài)的影響，表現(xiàn)為尺寸分布、多分散性和層狀?；谥|(zhì)膜流動(dòng)性的精確測量(熒光偏振)，我們預(yù)測了該參數(shù)對盤狀膠束中間體臨界尺寸的影響，從而預(yù)測了它們囊泡化和形成脂質(zhì)體的趨勢。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與基于Helfrich彎曲能模型的理論預(yù)測以及囊泡形成的能量學(xué)和熱力學(xué)分析進(jìn)行了比較。

微流控混合技術(shù)是生產(chǎn)復(fù)雜脂質(zhì)體制劑和芯片技術(shù)應(yīng)用的有前途的技術(shù)。釓配合物被用作MRI造影劑，脂質(zhì)體是釓在體內(nèi)成像和診斷學(xué)發(fā)展中應(yīng)用的多功能平臺。釓脂質(zhì)配合物也是通過冷凍TEM觀察脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的有用工具。

微流控混合過程中脂質(zhì)體形成機(jī)制的知識對于實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)規(guī)模的工藝優(yōu)化都非常重要。各種形式的雙層磷脂片段(BPF)被認(rèn)為是脂質(zhì)體形成過程中的中間體。例如，碟狀雙層膠束(DBM)是洗滌劑去除方法過程中形成的中間體，這些碟狀膠束的囊泡化產(chǎn)生了尺寸分布非常均勻的脂質(zhì)體。另一方面，堆積雙層片段是脂質(zhì)體前體-脂質(zhì)體方法中形成的主要中間體。由于微流控混合方法應(yīng)用于脂質(zhì)體的制備是基于類似的原理，如脂質(zhì)體前體-脂質(zhì)體方法或乙醇注射方法，因此有理由假設(shè)以DBM形式存在的BPF也是脂質(zhì)體形成過程中的中間體。

雙層膜膠束在水環(huán)境中的囊泡化是由于沿著膜膠束邊緣的非極性疏水尾部暴露在極性水分子中的線張力能量Z小化而驅(qū)動(dòng)的自發(fā)過程。囊泡化是平面雙層膜向球形轉(zhuǎn)變的過程，受到脂質(zhì)膜彎曲阻力的阻礙。因此，只有當(dāng)驅(qū)動(dòng)力足夠大時(shí)，才能克服相應(yīng)的彎曲阻力。

囊泡的形成在毫秒內(nèi)從單個(gè)兩親性脂質(zhì)分子的小聚集物開始，到快速自組裝過程中形成的圓盤狀雙層結(jié)構(gòu)(圖7A)。生長中的雙層結(jié)構(gòu)通常傾向于保持圓盤狀構(gòu)型，以保持整體線張力能處于Z小值。在達(dá)到某一臨界尺寸后，雙層結(jié)構(gòu)傾向于彎曲，以進(jìn)一步降低線能(圖7B,C)。Z后，杯狀結(jié)構(gòu)閉合形成球形囊泡，如圖7D所示。這一機(jī)制意味著囊泡的Z小尺寸與圓盤膠束的Z小尺寸有關(guān)。

從平面DBM到封閉囊泡的轉(zhuǎn)變過程中線能的減少被膜彎曲能的增加所抵消。囊泡的大小取決于膜尺寸生長動(dòng)力學(xué)，但有一個(gè)臨界膜尺寸，低于該尺寸的囊泡化在能量上是不利的。這意味著在DMB臨界直徑以下的囊泡不會(huì)形成，這也暗示了囊泡的臨界直徑，它取決于決定脂質(zhì)雙層流動(dòng)性/柔韌性的脂質(zhì)組成。

膽固醇對微流控混合制備脂質(zhì)體粒徑分布的影響
在相同的制備條件下，流速比為3:1和總流速為7 ml/min，微流控混合制備的脂質(zhì)體表現(xiàn)出不同的大小特性，這些特性取決于脂質(zhì)的飽和/不飽和鏈和膽固醇含量。流量比(FRR)是指通過微流控通道混合的有機(jī)和水介質(zhì)的體積比，總流量被定義為通過兩個(gè)入口泵入的有機(jī)和水介質(zhì)的體積比之和。

根據(jù)所需的組成將所需的單個(gè)脂質(zhì)溶解在無水乙醇中，并分別以4 mg/ml的濃度溶解在EtOH:DMSO(1:1)的混合物中，用于組成2、3、4和1。使用NanoAssemblr臺式儀器(Precision NanoSystems, Canada)在規(guī)定的流速比(FRR)為1:3和總流速(TFR)為7 ml/min下快速混合有機(jī)相和水相(Milli-Q水)，以形成1 mg/ml脂質(zhì)的單層脂質(zhì)體。在混合過程中，使用NanoAssemblr臺式加熱控制器附件(Precision NanoSystems, Canada)控制溫度。為了制備含有DSPC的脂質(zhì)體，分別將溫度設(shè)置為65 °C。

圖1，魚骨通道微流控混合原理及脂質(zhì)體的形成。有機(jī)水混溶溶劑(乙醇)含有形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)，水相含有待封裝的水溶性組分?；旌线^程在毫秒內(nèi)完成，脂質(zhì)體通過自組裝機(jī)制形成。各種計(jì)算機(jī)控制的線性注射器泵用于驅(qū)動(dòng)混合過程。

圖2，膽固醇對由不飽和磷脂(EPC)制備的脂質(zhì)體的大小、多分散性和各向異性的影響。(A)主軸上膽固醇濃度(mol%)與Z平均直徑(nm)的關(guān)系圖，小軸上DPH-TMA的穩(wěn)態(tài)熒光各向異性。(B)主軸上膽固醇濃度(mol%)與Z平均直徑(nm)的關(guān)系圖，小軸上多分散性指數(shù)(PDI)的關(guān)系圖。

圖3，膽固醇對飽和磷脂(DSPC)制備脂質(zhì)體的尺寸、多分散性和各向異性的影響。(A)主軸上膽固醇濃度(mol %)與Z平均直徑(nm)的關(guān)系圖，小軸上DPH-TMA的穩(wěn)態(tài)熒光各向異性。(B)主軸上膽固醇濃度(mol %)與Z平均直徑(nm)的關(guān)系圖，小軸上多分散性指數(shù)(PDI)的關(guān)系圖。

圖4，隨著膽固醇濃度從10 mol%增加到50 mol%，(A)EPC/膽固醇和(B)DSPC/膽固醇脂質(zhì)體的數(shù)量大小分布。

圖5，通過冷凍電鏡和原子力顯微鏡觀察脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)，脂質(zhì)體由微流控混合法制備，組成為DSPC:Chol 70:30，冷凍電鏡圖(左)和原子力顯微鏡圖(右)。

圖6，脂質(zhì)體的cryo-TEM圖像：(A)對照樣品(表1，組成3)，磷脂雙層寬度≈4.3 nm，(B)含有5%的Gd-脂質(zhì)的脂質(zhì)體(表1，組成3)，磷脂雙層寬度≈5.8 nm，(C)具有脂質(zhì)膜片段的脂質(zhì)體(表1，組成1)和(D)偶聯(lián)脂質(zhì)體。

圖7，自組裝過程中囊泡形成的示意圖。一個(gè)平面圓盤狀膠束(A)彎曲成一個(gè)球形帽(B和C)，Z終閉合形成一個(gè)囊泡(D)。

圖8，微流控混合脂質(zhì)體形成過程中可能出現(xiàn)的稀有過渡中間體示意圖。

圖9，NanoAssemblr儀器設(shè)置，精確測量混合盒中的溫度，并使用Zetasizer Ultra進(jìn)行尺寸分布測量(A)，在NanoAssemblr微流控盒中微流控混合芯片的“魚骨”結(jié)構(gòu)的細(xì)節(jié)(B)。

參考文獻(xiàn)：
Kotou?ek, J., Hubatka, F., Ma?ek, J. et al. Sci Rep 10, 5595 (2020).