試驗方法

實驗使用英國品牌Biochrom 的Bio 30+氨基酸分析儀分析各種細胞培養(yǎng)基的氨基酸濃度。簡單來說，培養(yǎng)基樣品使用離子交換液相色譜法（IEX）進行檢測，并用檸檬酸鋰緩沖液按照1:1稀釋。HP高效鋰系統(tǒng)程序分別取0,14,33,68和96天的細胞培養(yǎng)基樣品進行檢測，注射體積為20μL（樣品和標準品均為20μL），并通過使用添加了色氨酸（Trp）和谷氨酰胺的鈉水解緩沖液校準數(shù)據(jù)。進行實驗的細胞培養(yǎng)基分別是：DMEM (D6046, Sigma-Aldrich; SA) ，DMEM (11885084, ThermoFisher; TF), DMEM high-glucose (D6429, Sigma-Aldrich; HG), DMEM F-12 Ham (D8437, Sigma-Aldrich; HAM), 以及 DMEM GlutaMAX (10567014, ThermoFisher; GM)。所有的培養(yǎng)基均以4攝氏度保存。數(shù)據(jù)通過Biochrom自制的Pheonix軟件獲取，隨后使用OpenLab軟件進行數(shù)據(jù)分析。

Phoenix Software

Biochrom Bio 30+氨基酸分析儀實驗流程示意圖；系統(tǒng)包括控制單元（儀器左側）、自動取樣器（儀器右側）和Phoenix軟件。每個樣品的制備時間約為1分鐘。系統(tǒng)自動運行每個樣品的時間約為130分鐘（且系統(tǒng)可過夜運行），樣品之間有43分鐘的自動pH重置步驟。此離子交換色譜法（IEX）可在檢測時不受樣品介質中無機鹽、糖、維生素或其他添加劑的干擾

試驗結果

下圖為每種試驗培養(yǎng)基樣品中的氨基酸濃度（mg/L）。數(shù)據(jù)以第0天和第14天相應培養(yǎng)基中每種氨基酸檢測濃度的平均值±標準差（SD）表示。谷氨酰胺檢測中顯示的高值標準差SD表明樣品降解。#是指DMEM-GM培養(yǎng)基中存在的丙氨酸Ala-谷氨酰胺Gln的校準濃度值。

下圖為谷氨酰胺在時間流逝下的降解情況。圖為DMEM-SA培養(yǎng)基在第0天和第96天的鋰色譜圖。下方的標準色譜圖顯示出了各類氨基酸峰的標記。?；撬幔═au）和纈氨酸（Val）用作內部對照，氨（Amm）用作證實氨基酸分解的標志物。在實驗期間，谷氨酰胺的檢測濃度顯著降低，谷氨酰胺峰的曲線下面積（AUC）降低了20%。同時，氨的濃度增加，氨峰的曲線下面積上升了35%，表明谷氨酰胺正在降解。

下圖為谷氨酰胺降解的表征。圖A：第0天（細胞培養(yǎng)基到達后一天）檢測的氨基酸濃度與制造商數(shù)據(jù)表的偏差。這些點代表氨基酸的各個數(shù)據(jù)點（谷氨酰胺代表橙色，其他氨基酸代表藍色）。水平線表示平均值，虛線表示標準偏差SD。*代表與制造商數(shù)據(jù)表相比，p < 0.05，統(tǒng)計方式是Tukey事后檢驗的單因素方差分析。圖B：在實驗期間，谷氨酰胺的檢測濃度顯著降低（降低了26%）。數(shù)據(jù)符合指數(shù)衰減函數(shù)，并估算出了谷氨酰胺在DMEM-SA培養(yǎng)基中的半衰期（53.37±16.73天）。右上角的圖表顯示了第14天時對比DMEM-GM培養(yǎng)基中存在的丙氨酸Ala-谷氨酰胺Gln，所有細胞培養(yǎng)基中谷氨酰胺相對降解的情況。

自動化的離子交換色譜法（IEX）免受檢測樣品介質產生的數(shù)據(jù)干擾。下圖為第0天（藍色）和第14天（橙色）測試介質（不包含DMEM-GM培養(yǎng)基）的平均鋰色譜圖。彩色線表示所有色譜圖的平均值，陰影表示相關的標準差。色譜圖的高相關性（第0天r=0.94±0.05，第14天r=0.98±0.01）表明Biochome Bio30+的離子交換色譜法技術不受檢測介質中無機鹽、糖、維生素或其他添加劑的干擾。右上角的四個圖表明了從第0天到第14天檢測介質中谷氨酰胺的降解。下方的標準色譜圖顯示出了各類氨基酸峰的標記。?；撬幔═au）和纈氨酸（Val）用作內部對照，氨（Amm）用作證實氨基酸分解的標志物。

結論