Ficoll-Paque密度梯度介質(zhì)組成及機(jī)理淺析
1968年，Boyum, A1,2開發(fā)了一種簡單快速的離心技術(shù)，通過在Cytiva Ficoll PM400試劑中加入?Nyegaard & Co公司的IsoPaque（甲泛影酸鈉）3，制備成密度梯度介質(zhì)，用于人外周血中單個(gè)核細(xì)胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMCs）的分離，并逐漸測試用于不同物種4以及樣品來源，也就是Cytiva Ficoll-Paque密度梯度離心介質(zhì)的原型。
隨即1976年，Cytiva發(fā)布了即開即用型的Ficoll-Paque PLUS密度介質(zhì)，由Ficoll PM400、泛影酸鈉、EDTA和水組成4。Ficoll PM400可以單獨(dú)購買，是由蔗糖與表氯醇共聚反應(yīng)產(chǎn)生的聚蔗糖，水溶性佳，粘度低從而利于樣品快速沉降，滲透壓低因此不影響細(xì)胞密度及生理狀態(tài)6。Ficoll-Paque的密度和滲透壓則主要由泛影酸鈉提供，其見光易分解，需避光保存。
Ficoll-Paque PLUS的主要性質(zhì)：
密度：20℃，1.077±0.001 g/ml。
滲透壓：288-310 mOsm/kg。
內(nèi)毒素：LAL鱟試劑檢測，內(nèi)毒素很低（<0.12 EU/mL）。
無菌狀態(tài)：灌裝后高壓蒸汽滅菌，121℃ F0最少15分鐘。
儲(chǔ)存條件：未開封狀態(tài)下，4-30℃可避光保存三年。開封后需保存在4-8℃。
根據(jù)斯托克斯定律，顆粒的沉降速率v，和顆粒直徑（d）、樣品密度（ρp）和溶液密度（ρl）之差成正比；與溶液的粘稠度（η）成反比。
當(dāng)不同細(xì)胞經(jīng)過同一密度離心介質(zhì)，不同顆粒直徑和密度的細(xì)胞，沉降速率不同，從而被分開。
圖1：顆粒沉降速率公式7
Boyum, A等4根據(jù)多年文獻(xiàn)報(bào)道以及實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，繪制出外周血各個(gè)細(xì)胞組分的密度分布，如圖2。
按照密度從低到高排序依次為：單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、紅細(xì)胞，注意不同類型細(xì)胞均存在一定范圍內(nèi)的密度分布且存在交叉。
圖2：人外周血中細(xì)胞密度分布圖
將稀釋后的外周血或血細(xì)胞8,9小心地鋪到Ficoll-Paque PLUS密度梯度介質(zhì)上面，啟動(dòng)離心時(shí)，上層血液中的細(xì)胞沉降至血液/Ficoll-Paque PLUS界面，從而和PM 400接觸。
在室溫下，F(xiàn)icoll PM 400可以有效的促進(jìn)紅細(xì)胞聚集，從而加速紅細(xì)胞的沉降，使其沉淀在管底5。根據(jù)密度差異，從下往上各層細(xì)胞分布依次為：紅細(xì)胞、粒細(xì)胞、Ficoll-Paque層、單個(gè)核細(xì)胞層、血漿層，如圖3。
其中研究最多的是單個(gè)核細(xì)胞層（mononuclear cells，MNCs），血液樣品即為PBMCs，包括單核細(xì)胞（monocytes）及淋巴細(xì)胞，離心后位于血漿與Ficoll-Paque層之間，也叫白膜層；部分客戶也會(huì)回收Ficoll-Paque PLUS層之下的組分，通過裂紅試劑去除紅細(xì)胞，回收粒細(xì)胞用于研究5。
圖3：Ficoll-Paque密度梯度介質(zhì)用于外周血單個(gè)核細(xì)胞PBMCs的分離。左圖：將稀釋后的血液小心鋪在Ficoll-Paque密度梯度介質(zhì)上。
中間圖：離心后出現(xiàn)分層，單個(gè)核細(xì)胞出現(xiàn)在血漿與Ficoll-Paque層之間，也叫白膜層。
右圖：吸棄頂端的血漿或儲(chǔ)存?zhèn)溆?，用移液管等小心吸取回收白膜層?/span>
Ficoll-Paque密度梯度介質(zhì)應(yīng)用匯總
2005 年，Cytiva發(fā)布了Ficoll-Paque PREMIUM，密度和經(jīng)典的Ficoll-Paque PLUS同樣為1.077 g/mL。
Ficoll-Paque Premium是在嚴(yán)格控制的環(huán)境下生產(chǎn)的，符合ISO 13485:2003，符合歐盟委員會(huì)GMP 指南無菌藥品生產(chǎn)要求，依從美國藥典章節(jié)<1043>的相關(guān)規(guī)定，因此推薦用作臨床研究和細(xì)胞治療5，提供RSF法規(guī)支持文件。
為了拓展應(yīng)用，2007年12月Cytiva又發(fā)布了Ficoll-Paque PREMIUM 1.084和Ficoll-Paque PREMIUM 1.073。不同密度梯度離心介質(zhì)的應(yīng)用總結(jié)，如表1。
表1：不同F(xiàn)icoll-Paque密度梯度離心介質(zhì)的應(yīng)用分類5
據(jù)此，智薈專線將分期為大家解讀Ficoll-Paque密度梯度離心介質(zhì)的不同應(yīng)用：
1
典型應(yīng)用的特殊情況：Ficoll-Paque分離”病人”外周血PBMCs的注意事項(xiàng)
2
Ficoll-Paque分離腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TILs）
3
Ficoll-Paque分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）
4
Ficoll-Paque PREMIUM 1.073用于分離人間充質(zhì)干細(xì)胞
Ficoll-Paque使用注意事項(xiàng)請參考微文：
? 智薈錦囊之細(xì)胞分離液Ficoll知多少？
PBMCs分離應(yīng)用中病人樣本的特殊性
本期，我們將首先為大家解讀人外周血PBMCs分離應(yīng)用中，病人樣本的特殊性。
在感染性疾病中，白細(xì)胞（包括單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以及粒細(xì)胞）的特征性變化，對于研究發(fā)病機(jī)理及治療非常重要15。
以膿毒癥為例，根據(jù)2016年國際共識(shí)16，膿毒癥被定義為由感染引起的宿主反應(yīng)失調(diào)，造成危及生命的器官功能障礙。其發(fā)病機(jī)理尚未完全明確，免疫病理學(xué)研究對其分子內(nèi)型界定、發(fā)展新的治療策略以及患者護(hù)理至關(guān)重要17 ，這其中，外周血PBMCs樣本必不可少。
2008年，EricaL. T. van den Akker等18研究了使用Ficoll-Paque PLUS（1.077 g/mL）分離健康人和膿毒癥病人血液中白細(xì)胞的典型特征。樣品來自4位健康人（無急性和慢性疾病，年齡51、36、21、3歲）和3位膿毒癥病人（診斷24小時(shí)內(nèi)取樣，不含嗜中性白血球減少癥及免疫抑制療法樣本），如表2。
表2：3位病人樣本概況。三者的白細(xì)胞數(shù)量均有上升，尤其是病人1。從分化數(shù)據(jù)來看，淋巴細(xì)胞都有不同程度的降低。均有未成熟粒細(xì)胞-桿狀核細(xì)胞（band cells）和髓細(xì)胞（myelocytes）的出現(xiàn)13。
參考Ficoll-Paque PLUS標(biāo)準(zhǔn)操作流程，使用肝素抗凝管（直徑10 mm）采集5 mL新鮮血液，生理鹽水進(jìn)行2倍稀釋，小心地鋪到10 mL Ficoll-Paque PLUS溶液上。20℃，400 g離心20 min。取白膜層即獲得單個(gè)核細(xì)胞，包括單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞；回收Ficoll-Paque以下細(xì)胞層，加入10 mL氯化銨裂紅試劑，冰上30 min裂解紅細(xì)胞，獲得粒細(xì)胞。
二者均使用生理鹽水離心（850 g，5 min）清洗兩次，臺(tái)盼藍(lán)染色顯示活細(xì)胞比例高于95%。 將分離得到的白膜層MNCs及底層粒細(xì)胞，使用anti-CD14以及anti-CD45抗體進(jìn)行標(biāo)記，并進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)（FACS）分析。
結(jié)果如圖1所示，左側(cè)為1位健康人樣本（無任何急性和慢性疾?。覀?cè)為膿毒癥病人1的樣本。相對于健康人，病人樣本在中間白膜層（interface）出現(xiàn)了明顯的粒細(xì)胞（R3）污染。
圖4：健康人以及膿毒癥病人（分別取一個(gè)血樣）流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果圖。使用Ficoll-Paque PLUS 1.077分離白膜層外周血單核細(xì)胞（interface，圖a）以及底部粒細(xì)胞（bottom fraction， 圖b，已裂紅），anti-CD14以及anti-CD45抗體進(jìn)行標(biāo)記。
R1：橘色，CD45-，如血小板或紅細(xì)胞。
R2：綠色，CD14+，單核細(xì)胞。
R3：粉色，CD45弱陽，粒細(xì)胞。R4：藍(lán)色，CD45強(qiáng)陽，淋巴細(xì)胞。
將4位健康人和3位病人樣本的流式結(jié)果匯總后，分析白膜層和底層的細(xì)胞分布及比例，如圖5。
圖5：4位健康人和3位病人血樣，使用Ficoll-Paque PLUS 1.077分離白膜層外周血單核細(xì)胞（interface，圖a）以及底部粒細(xì)胞（bottom fraction， 圖b，已經(jīng)過裂紅處理）后，進(jìn)行FACS檢測， 計(jì)算得到不同類型細(xì)胞的百分比。4位健康人取平均值作為control。
灰色：淋巴細(xì)胞；藍(lán)色點(diǎn)：單核細(xì)胞；
白色：粒細(xì)胞。
結(jié)果顯示：
白膜層MNCs：健康人樣本中含有88-100%的MNCs，只有0-12%（Ave. 11%）的粒細(xì)胞。但是，病人樣本中含有11–52%單個(gè)核細(xì)胞MNCs以及48–89%（Ave. 62%，p=0.007）的粒細(xì)胞，并具有個(gè)體差異12。
管底部分離到的粒細(xì)胞純度高，且在健康人（92–98%）和病人（97–99.8%）之間無顯著差異，可以用于后續(xù)研究。
通過Cytospin實(shí)驗(yàn)，將單層細(xì)胞沉積到載玻片上，使用May-Grünwald-Giemsa染色（MGG染色），顯微鏡下檢測白細(xì)胞分化，一方面佐證了FACS的結(jié)果，另外發(fā)現(xiàn)，膿毒癥病人白膜層以及管底部分離的粒細(xì)胞，均含有未成熟的粒細(xì)胞，即4-21%的桿狀核細(xì)胞和髓細(xì)胞，其余為成熟的多形核粒細(xì)胞（Polymorphonuclear Leukocytes, PMNs）。
相反地，健康人樣品中，則只有成熟的PMNs，基本沒有檢出未成熟形態(tài)粒細(xì)胞15或比例非常低（0.4 – 1.6%）17。對于成熟粒細(xì)胞的分離，CD16和CD11b作為常用標(biāo)記物，可用于磁珠分選19。
綜上，在病人樣品中，一方面膿毒癥造成淋巴細(xì)胞絕對數(shù)量的減少，即膿毒癥相關(guān)的淋巴細(xì)胞減少癥（SALT）17；另一方面由于疾病誘導(dǎo)的應(yīng)力反應(yīng)，部分粒細(xì)胞為未成熟狀態(tài)，密度較低而停留在白膜層中。
因此，造成白膜層粒細(xì)胞污染較多，單個(gè)核細(xì)胞比例顯著降低。在動(dòng)物中也有類似情況，豬瘟也會(huì)造成Ficoll-Paque分離的豬血液樣本中，白膜層中出現(xiàn)未成熟粒細(xì)胞的污染20。
由于未成熟粒細(xì)胞的大小和密度有差異，它們通過Ficoll密度介質(zhì)的行為不同3，較難通過密度梯度進(jìn)一步分離。
Sergey N Preobrazhensky等21發(fā)現(xiàn)，將10例健康人的血液先使用氯化銨裂紅，剩余的白細(xì)胞程序降溫并冷凍保存在-80度，3個(gè)月后進(jìn)行密度梯度分離，白膜層中有明顯的粒細(xì)胞污染。使用anti-CD15抗體進(jìn)行FACS分析，發(fā)現(xiàn)每例冷凍白細(xì)胞樣本中，粒細(xì)胞CD15抗原表達(dá)均顯著高于MNCs。后續(xù)，作者嘗試將冷凍后的樣本先使用anti-CD15磁珠孵育，再進(jìn)行分離，則白膜層幾乎沒有粒細(xì)胞。
作者建議類似操作推廣到其它白膜層會(huì)出現(xiàn)粒細(xì)胞污染的樣品中，包括前述膿毒癥患者以及熱力燒傷（白膜層有40%粒細(xì)胞污染）22等病人樣品，以及長時(shí)間室溫保存血樣中23,24。類似問題還出現(xiàn)在慢性感染9,25,26、自身免疫性疾病27、病毒感染（如COVID-19）33、健康妊娠人群28中，都發(fā)現(xiàn)有更低密度的粒細(xì)胞存在。
CD15也是中性粒細(xì)胞的分子標(biāo)記，在中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞表面以及部分單核細(xì)胞表面都有表達(dá)。
Judith Schenz等17證實(shí)，使用密度梯度介質(zhì)分離膿毒癥病人外周血PBMCs后，通過anti-CD15磁珠分選可以有效去除白膜層中的低密度粒細(xì)胞，其表現(xiàn)為未成熟的中性粒細(xì)胞特征18并具有?髓源性免疫抑制功能，且在重癥患者中比例更高29。
進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)，anti-CD15磁珠分選不影響剩余PBMCs的功能，如細(xì)胞表面CD分子表達(dá)、線粒體超氧化物ROS表達(dá)（細(xì)胞沒有被進(jìn)一步活化）、單核細(xì)胞表面 HLA-DR表達(dá)（抗原遞呈功能）、刺激后細(xì)胞因子分泌。
Cytiva細(xì)胞治療整體解決方案
通過Ficoll-Paque密度梯度離心介質(zhì)，從健康人或病人樣本中分離得到的PBMCs細(xì)胞，還可以進(jìn)一步使用磁珠或流式分選、細(xì)胞因子刺激、貼壁培養(yǎng)等方法篩選特定的細(xì)胞類型，如T淋巴細(xì)胞30、NK細(xì)胞31,32等。
Cytiva提供自動(dòng)化、全封閉、符合GMP要求的全流程解決方案，如圖6：
搭配Ficoll-Paque密度梯度介質(zhì)，全自動(dòng)、封閉細(xì)胞處理系統(tǒng)Sepax C-Pro，可用于細(xì)胞分離富集、磁珠孵育、病毒離心感染、細(xì)胞濃縮，洗滌、稀釋和分裝，適用于小于1 L樣品。
2024年上市的Sefia Select系統(tǒng)：整合了Sefia S-2000系統(tǒng)（類似Sepax C-Pro，增加了溫控和取樣模塊，單次最大處理量可達(dá)10 L）以及磁力分離模塊， 實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分離富集、磁珠孵育與分選、細(xì)胞收獲與制劑分裝自動(dòng)化。
2024年上市的Sefia expansion系統(tǒng)，用于細(xì)胞的激活、轉(zhuǎn)導(dǎo)和擴(kuò)增培養(yǎng)。同時(shí)，Cytiva還推出了開創(chuàng)性的ELEVECTA穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，用于AAV的生產(chǎn)。
用于免疫細(xì)胞大量擴(kuò)增的Xuri W25波浪式生物反應(yīng)器，培養(yǎng)體積300 mL-25 L，低剪切力，可灌流。
用于細(xì)胞復(fù)蘇的VIA Thaw，用于程序性降溫冷凍的VIA Freeze。
HyClone經(jīng)典培養(yǎng)基、Xuri T細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基以及Xuri IL-2、IL-15、IL-21生長因子。
Chronicle自動(dòng)化軟件，為全自動(dòng)云端管理系統(tǒng)，幫助實(shí)現(xiàn)數(shù)字化制造執(zhí)行系統(tǒng)（MES）。
圖6：Cytiva細(xì)胞治療整體解決方案
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