通過(guò)時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)得到激發(fā)態(tài)分布[M*]。激發(fā)態(tài)分子濃度[M*]在時(shí)間t的衰減為：

其中，[M*]₀是在時(shí)間為0時(shí)處于激發(fā)態(tài)分子的濃度。t = 0相當(dāng)于使用TCSPC時(shí)激發(fā)脈沖的到達(dá)時(shí)間。存在多種相互競(jìng)爭(zhēng)的衰減過(guò)程，分別為輻射和非輻射途徑。與這些參數(shù)相關(guān)的速率常數(shù)是kr和knr，分別是輻射衰減和非輻射衰減之和的速率常數(shù)。用k來(lái)表示所有速率常數(shù)的總和。

然而，我們不能直接測(cè)試激發(fā)態(tài)分子的濃度。相反，可測(cè)試的參數(shù)是熒光強(qiáng)度I。在時(shí)間t的熒光強(qiáng)度如方程2所示。

其中τ是熒光壽命。τ與速率常數(shù)的關(guān)系如下：

最簡(jiǎn)單的熒光衰減為單指數(shù)衰減：

其中t是時(shí)間，τ是熒光壽命，B是指前因子。熒光壽命定義為強(qiáng)度降至初始值的1/e（=0.368）所需的時(shí)間（圖1a）。熒光衰減通常以對(duì)數(shù)坐標(biāo)顯示，對(duì)數(shù)坐標(biāo)給出了單指數(shù)衰減的線性關(guān)系（圖1b）。

圖1（a）在線性坐標(biāo)上的的熒光衰減；（b）在對(duì)數(shù)坐標(biāo)上的的熒光衰減。¹

擬合方法：

必須用適當(dāng)?shù)暮瘮?shù)對(duì)熒光衰減進(jìn)行擬合。TCSPC數(shù)據(jù)的擬合有兩種常用方法，尾部擬合和解卷積擬合。在多次迭代后，壽命和B指前因子會(huì)發(fā)生變化，以優(yōu)化擬合。

擬合評(píng)估：

可以通過(guò)計(jì)算X²來(lái)評(píng)估擬合。通過(guò)原始數(shù)據(jù)點(diǎn)和擬合點(diǎn)之間的差異，以量化數(shù)據(jù)擬合的效果。測(cè)量的熒光衰減函數(shù)N(t_k)和計(jì)算的衰減函數(shù)N_C(t_k)之間的差值通過(guò)數(shù)據(jù)點(diǎn)的數(shù)量n進(jìn)行評(píng)估。

X²值為1表示通過(guò)擬合。如果值高于1.2，則表明擬合不能很好地描述此衰減?？山邮艿腦²在不同體系中有所不同，其與噪聲相關(guān)。在測(cè)試樣品熒光衰減之前需要確定單組分熒光團(tuán)，以確定體系可實(shí)現(xiàn)的靈敏度。

圖2 （a）使用穩(wěn)態(tài)瞬態(tài)熒光光譜儀FS5測(cè)試的9AA的熒光衰減；（b）Fluoracle軟件中的單指數(shù)擬合分析。

圖中τ是通過(guò)將單個(gè)指數(shù)尾部擬合到Fluoracle中來(lái)確定的。Fluoracle軟件通過(guò)調(diào)整τ和B的值，直到獲得具有最低殘差的最小二乘擬合，即16.2?ns（圖2b）。

當(dāng)樣品含有多個(gè)熒光團(tuán)，或單個(gè)分子具有多個(gè)熒光發(fā)射體系（如構(gòu)象異構(gòu)體或互變異構(gòu)體）時(shí)，必須使用多指數(shù)模型：其中I(t)是作為時(shí)間函數(shù)t的熒光強(qiáng)度，歸一化為t=0時(shí)的強(qiáng)度，τ_i是第i個(gè)衰變組分的熒光壽命，B_i是該組分的分?jǐn)?shù)振幅。

理論上，模型中可以包含的指數(shù)分量的數(shù)量沒(méi)有限制?？梢酝ㄟ^(guò)增加熒光組分的數(shù)量來(lái)實(shí)現(xiàn)更好的擬合，但要符合樣品實(shí)際的光物理過(guò)程。為了使壽命組分有意義，它們必須代表樣品中發(fā)生的不同光物理過(guò)程，因此應(yīng)根據(jù)預(yù)期光物理過(guò)程來(lái)確定熒光組分的數(shù)量。

多指數(shù)衰減的一個(gè)例子是熱激活延遲熒光（TADF）材料。TADF材料熒光衰減為雙指數(shù)擬合。如圖3a所示，可以用兩個(gè)指數(shù)衰減來(lái)精確擬合，τ₁=65 ns和τ₂=?1061 ns，其對(duì)應(yīng)材料S1激發(fā)態(tài)的即時(shí)熒光和延遲熒光。

圖3 （a） 使用穩(wěn)態(tài)瞬態(tài)熒光光譜儀FS5測(cè)量的TADF的雙指數(shù)熒光衰減；（b）Fluoracle中的擬合結(jié)果。

有許多樣品類(lèi)型不遵循指數(shù)衰減行為。無(wú)機(jī)材料（包括半導(dǎo)體和量子點(diǎn)等體系）的光致發(fā)光衰減通常就是這種情況。非指數(shù)衰減的一個(gè)例子是涂有硫化鋅層（InP/ZnS）的磷化銦量子點(diǎn)的光致發(fā)光，如圖4所示。

圖4 (a) 使用穩(wěn)態(tài)瞬態(tài)熒光光譜儀FS5測(cè)量的InP/ZnS量子點(diǎn)的光致發(fā)光衰減；

(b)Fluoracle?中相應(yīng)的擬合分析，其中突出顯示了振幅加權(quán)平均壽命（藍(lán)色框）和強(qiáng)度加權(quán)平均壽命（橙色框）。

Fluoracle軟件中顯示了兩種平均壽命，因?yàn)槠骄鶋勖胁恢挂粋€(gè)定義。文獻(xiàn)中最常報(bào)道的兩種平均壽命是振幅加權(quán)平均壽命和強(qiáng)度加權(quán)平均壽命。需要事先了解材料衰減的內(nèi)在機(jī)制，才能選擇應(yīng)該使用的平均壽命。

振幅平均壽命<τ>_amp，通過(guò)其分?jǐn)?shù)振幅（B_i）對(duì)每個(gè)壽命組分（τ_i）進(jìn)行加權(quán)：⁴

其中：

振幅平均壽命是穩(wěn)定狀態(tài)下熒光團(tuán)的特征，并且在數(shù)學(xué)上與速率常數(shù)相關(guān)。³振幅平均壽命通常用于熒光團(tuán)之間發(fā)生能量轉(zhuǎn)移的生物系統(tǒng)中。因此，由于其異質(zhì)性及其與周?chē)h(huán)境的相互作用，其壽命衰減是多指數(shù)的。

強(qiáng)度平均值更加強(qiáng)調(diào)較長(zhǎng)的壽命，降低了分?jǐn)?shù)振幅變化和較短壽命的可見(jiàn)性。這使得平均值在擬合過(guò)程中對(duì)熒光組分?jǐn)?shù)量的變化顯得更加穩(wěn)定。²強(qiáng)度平均壽命適用于例如發(fā)射體系的集合，例如嵌入光子晶體中的量子點(diǎn)，以及熒光依賴于納米晶體尺寸的半導(dǎo)體納米晶體。⁵相同材料但不同尺寸的納米晶體將以不同的波長(zhǎng)發(fā)射，因此，應(yīng)考慮納米晶體的整個(gè)激發(fā)體系的平均壽命。

擬合最好通過(guò)仔細(xì)評(píng)估體系中的光物理過(guò)程來(lái)評(píng)估，而數(shù)學(xué)計(jì)算的“最優(yōu)”解并不總是合適的。以與非指數(shù)QD系統(tǒng)相同的方式處理單組分稀土樣品為例，應(yīng)該始終根據(jù)樣品本身特性來(lái)決定擬合方法。擬合在很大程度上取決于用戶輸入的值（擬合范圍、背景、建議使用壽命）。擬合結(jié)果受這些值的微小變化的影響很大，這些變化將對(duì)最終擬合產(chǎn)生無(wú)法計(jì)算的影響。

本文探討了擬合單個(gè)樣品熒光衰減的基本原理。為了提高對(duì)體系的理解，可以一起分析多個(gè)衰減函數(shù)。對(duì)熒光衰減的擬合，應(yīng)始終考慮樣品潛在的光物理過(guò)程，根據(jù)樣品本身特性確定擬合方式。愛(ài)丁堡一體化穩(wěn)態(tài)瞬態(tài)熒光光譜儀FS5可使用Fluoracle?軟件對(duì)樣品進(jìn)行單指數(shù)、多指數(shù)或非指數(shù)擬合，滿足多樣化樣品擬合需求。

1. D. M. Jameson, Introduction to Fluorescence, 2014.

2. E. Fi?erová and M. Kubala, Mean fluorescence lifetime and its error, J Lumin, 2012, 132, 2059–2064.

3. A. Sillen and Y. Engelborghs, The Correct Use of ‘Average’ Fluorescence Parameters, Photochem Photobiol, 1998, 67, 475–486.

4. B. Valeur and M. N. Berberan-Santos, Molecular Fluorescence, Wiley-VCH, 2nd edn., 2012.

5. G. Zatryb and M. M. Klak, On the choice of proper average lifetime formula for an ensemble of emitters showing non-single exponential photoluminescence decay, Journal of Physics Condensed Matter, DOI:10.1088/1361-648X/ab9bcc.