重鏈抗體的可變結(jié)構(gòu)域 (VHH) 也被稱為納米抗體 (Nanobodies/Nbs) ，是來源于駱駝科動物重鏈抗體的單體抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
Nbs具有分子尺寸小、靶向選擇性高、高溶解性和高穩(wěn)定性等顯著特點(diǎn)，這些特點(diǎn)都極大促進(jìn)了高質(zhì)量的藥物開發(fā)。同時Nbs很容易在各種表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，例如大腸桿菌和酵母等。由于以上這些原因，Nbs成為了蛋白質(zhì)工程、診斷和疾病治療的首選抗體片段之一，截止到2023年FDA已經(jīng)批準(zhǔn)了兩款基于Nbs的治療方法。目前有許多正處于臨床前和臨床研究中的Nbs候選藥物，涵蓋了廣泛的疾病類型，包括癌癥、免疫系統(tǒng)疾病、傳染病和神經(jīng)退行性疾病。[1]
VHH特點(diǎn)：
分子尺寸小，分子量約15 kDa；
組織穿透力強(qiáng)，可以有效穿透血腦屏障 (blood-brain barrier) ；[2]
較高的穩(wěn)定性和溶解度，熱穩(wěn)定性強(qiáng)；[3]
免疫原性較低；
半衰期短，易于代謝。[4]
MabSelect PrismA
Protein A親和層析填料長期以來一直被用于純化單克隆抗體 (mAbs) ，被各種規(guī)模的生物制藥企業(yè)廣泛應(yīng)用。Protein A和抗體的結(jié)合主要發(fā)生在單抗的Fc區(qū)，位于CH2和CH3之間。與此同時，Protein A也可以結(jié)合抗體Fab區(qū)可變重鏈上的VH3序列。
所開發(fā)的多款現(xiàn)代Protein A填料，例如MabSelect SuRe、MabSelect SuRe LX、MabSelect PrismA等，具有高結(jié)合載量以及高耐堿性等特點(diǎn)。
圖1：單克隆抗體上不同的結(jié)合位點(diǎn)以及現(xiàn)代Protein A填料選擇
MabSelect PrismA純化VHH
在Tricorn 5/50柱子中填充1 mL MabSelect PrismA填料，將150 mL含有0.2 g/L VHH的大腸桿菌粗提物（Load=30 g VHH/L填料）上樣到1 mL MabSelect PrismA柱子，保留時間為6分鐘。VHH樣品在50 mM pH 3.5的醋酸鈉溶液中洗脫獲得，純化結(jié)果如圖2所示。[6]
圖2：使用MabSelect PrismA捕獲大腸桿菌表達(dá)的VHH
對本次純化中Load和Eluate分別取樣進(jìn)行檢測，經(jīng)過MabSelect PrismA純化所得的VHH樣品和上柱前相比，宿主蛋白的去除率達(dá)到4.3 log，而配基脫落僅10 ppm（表1）。
表1：MabSelect PrismA純化VHH的檢測數(shù)據(jù)對比[6]
將純化過的VHH樣品分別上樣到裝有不同Protein A填料的1 mL HiTrap預(yù)裝柱中，分別是HiTrap MabSelect（rprotein A配基）、HiTrap MabSelect SuRe、HiTrap MabSelect PrismA這三種，然后進(jìn)行酸性pH值洗脫。能夠從圖3中看到，MabSelect和MabSelect PrismA表現(xiàn)出類似的層析行為，而MabSelect SuRe顯示出和VHH僅有較弱的相互作用。
圖3：VHH和 (A) MabSelect、(B) MabSelect SuRe、(C) MabSelect PrismA三種不同填料的層析結(jié)果[6]
進(jìn)一步地對VH3序列的關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行點(diǎn)突變，并測試氨基酸點(diǎn)突變后的VHH與上述3種現(xiàn)代Protein A填料的相互作用強(qiáng)弱，表2中的數(shù)據(jù)表明：在少數(shù)特定情況下，MabSelect SuRe填料也可以與VH3區(qū)域發(fā)生相互作用，而MabSelect和MabSelect PrismA填料對VHH序列變化的敏感性較低，在多數(shù)情況下都能和VHH樣品結(jié)合。
表2：MabSelect、MabSelect SuRe和MabSelect PrismA填料與點(diǎn)突變VHH的相互作用[6]
MabSelect VH3
2023年11月上市了MabSelect VH3親和填料，MabSelect VH3采用經(jīng)過重組改造的protein A配基，該配基只與包含VH3序列家族的重鏈可變區(qū)的人源抗體發(fā)生相互作用，VH3配基與傳統(tǒng)的protein A配基相比，F(xiàn)c區(qū)相互作用已被敲除，而VH3區(qū)相互作用得到增強(qiáng)。VH3序列家族是商業(yè)化生物制品中抗體最常見的VH類型。利用這一特性可有效分離雙特異性抗體 (bsAb) 和抗體片段，例如抗原結(jié)合區(qū)片段 (Fab) 、單鏈可變片段 (scFv) 和重鏈可變區(qū) (VHH) 。
對包含VH3序列家族的雙特異性抗體以及抗體片段具有高結(jié)合載量；
在捕獲雙特異性抗體時，對于產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)具有良好的分辨率；
耐堿穩(wěn)定性：使用0.5 M NaOH清洗時保持穩(wěn)定，可大大降低生物負(fù)荷的風(fēng)險并具有較長的填料使用壽命；
與Fab VH3區(qū)域的單一相互作用，比具有雙重相互作用（Fab及Fc區(qū)）的親和配基更為有利，因?yàn)檫@種單一作用可更高效地將不需要的錯配抗體和片段從目標(biāo)bsAb中分離；
使用專為MabSelect VH3填料設(shè)計的VH3 Ligand ELISA試劑盒（貨號29737000）可輕松測量配基脫落。
經(jīng)過測試，針對VHH樣品MabSelect VH3填料的動態(tài)結(jié)合載量略高于MabSelect PrismA填料大約11%–14%。如圖4所示，MabSelect VH3填料與VHH的動態(tài)結(jié)合載量為36-39 g/L，同時MabSelect VH3填料和VHH的動態(tài)結(jié)合載量不太受保留時間長短的影響。[7]尤其是在較短的保留時間下，填料和VHH的高結(jié)合載量為生物制藥提供了強(qiáng)勁的生產(chǎn)優(yōu)勢。
圖4：不同保留時間下MabSelect VH3和MabSelect PrismA填料和VHH的動態(tài)結(jié)合載量對比[7]
高動態(tài)結(jié)合載量不僅在填料壽命的開始階段非常重要，同時填料也需要能夠承受嚴(yán)苛的清潔再生條件以降低生物污染事件發(fā)生的風(fēng)險，為了實(shí)現(xiàn)填料的高利用率，動態(tài)結(jié)合載量必須在填料整個壽命周期內(nèi)保持穩(wěn)定。
將MabSelect VH3填料的初始動態(tài)結(jié)合載量設(shè)定為100%（即第0個周期，填料未使用NaOH處理時），之后每16個CIP循環(huán)后用經(jīng)過純化的曲妥珠單抗以及VHH樣品分別測量填料的動態(tài)結(jié)合載量。測試結(jié)果表明：經(jīng)過96次循環(huán)的0.5M NaOH清潔再生后，MabSelect VH3填料對曲妥珠單抗和VHH的相對剩余結(jié)合載量均高達(dá)93%（圖5）。值得一提的是，在經(jīng)過多達(dá)200次CIP循環(huán)后，MabSelect VH3填料對于曲妥珠單抗的相對剩余結(jié)合載量仍然有84%。[7]
圖5：CIP條件為0.5 M NaOH接觸時間15分鐘，經(jīng)過96次CIP循環(huán)后MabSelect VH3填料對mAb和VHH的相對剩余結(jié)合載量高達(dá)93%[7]
小編小結(jié)
VHH即納米抗體由于其分子量小、組織穿透力強(qiáng)、穩(wěn)定性強(qiáng)、免疫原性低等諸多特點(diǎn)，作為抗體藥物的潛力賽道吸引了廣泛的關(guān)注，在疾病診斷及治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景。所開發(fā)的現(xiàn)代Protein A填料MabSelect PrismA以及MabSelect VH3在VHH純化上均有不俗表現(xiàn)，同時具備了高結(jié)合載量以及耐堿穩(wěn)定性。
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參考文獻(xiàn)
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