PCR技術(shù)因其快速、靈敏、特異等特性廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)的研究與檢測中，但卻對實驗環(huán)境及操作有著嚴(yán)格的要求，稍有不當(dāng)則會導(dǎo)致假陽性產(chǎn)生。污染嚴(yán)重時甚至可以持續(xù)數(shù)月，很難在短時間內(nèi)控制。換引物、換試劑、換耗材、換實驗樓，甚至有人跑到兩公里外的實驗室加樣也無濟于事，如何避免及處理假陽性問題已經(jīng)成為每一位PCR實驗人員的必修課。

01 什么是PCR假陽性

假陽性結(jié)果示例1（Q1600熒光檢測）

PCR假陽性包括兩種，即檢測陰性材料得到陽性結(jié)果，檢測空白對照（加入去離子水）出現(xiàn)陽性結(jié)果，實驗中設(shè)立的陰性對照可以提示有無假陽性結(jié)果出現(xiàn)。

假陽性結(jié)果示例2（Repure-A電泳檢測）

02 PCR假陽性的原因有哪些

PCR擴增產(chǎn)物污染是導(dǎo)致假陽性的重要因素，因其拷貝量大，微量的污染源即可導(dǎo)致陽性結(jié)果，其中以氣溶膠污染Z為常見。其次，PCR試劑及樣本的交叉污染也會導(dǎo)致假陽性。PCR試劑的污染包括加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液的核酸污染，樣本污染主要是取樣工具之間的交叉污染或加樣污染。

此外，在實驗室操作中經(jīng)常會用到陽性參考品，參考品大多數(shù)由某些克隆質(zhì)粒制作而成，克隆質(zhì)粒使用不當(dāng)也會造成污染。

03 假陽性的預(yù)防及解決措施

①規(guī)范實驗室設(shè)計：實驗室包括配液區(qū)、DNA提取區(qū)、擴增區(qū)、電泳區(qū)，在連續(xù)獨立的空間完成不同實驗操作。若沒有專業(yè)的實驗室，至少需要保證配液、加樣與檢測在不同的區(qū)域；

②規(guī)范實驗室操作：實驗室定期通風(fēng)與消毒，儀器定期清潔，并使用氣溶膠清除劑。使用一次性用具，小心操作，避免交叉污染；

③規(guī)范試劑耗材管理：新買試劑需進(jìn)行實驗前驗證并進(jìn)行分裝，所用耗材需高壓消毒；

④實驗前預(yù)防：首先需保證所設(shè)計引物的特異性，防止引物自擴增，其次還可使用UNG酶及dUTP防污染體系；

⑤污染后處理：如遇污染應(yīng)立即停止實驗，采取開窗通風(fēng)，紫外燈照射，噴霧裝置噴灑等操作，此后若連續(xù)三天陰性對照正常即可恢復(fù)正常實驗。

04 二維梯度PCR可有效避免多次PCR帶來的假陽性風(fēng)險

DY輪PCR的污染基本可以避免，PCR實驗越頻繁，則越容易污染，能一次做50個，不要分開5次每次做10個。而對于科研實驗而言，使用二維梯度PCR可以一次得到96個溫度組合，而不需要分開8次，每次做12個梯度，在節(jié)省人力物力的同時也大大降低了假陽性的風(fēng)險。

RePure-D 二維復(fù)合梯度基因擴增儀

 RePure-C  二維梯度基因擴增儀

“上YZ未病”，對于PCR的初學(xué)者而言，做實驗之前首先需要樹立“預(yù)防”的觀念，嚴(yán)格把控樣本處理、核酸提取、擴增及檢測的每一過程。同時，在實際操作中也需要注意規(guī)范實驗步驟，避免因加樣失誤而導(dǎo)致的交叉污染，從源頭杜絕假陽性現(xiàn)象。