在生物催化的賽道上，科研人員常面臨這樣的困境：海量酶變體庫中藏著理想的催化 "明星"，但傳統(tǒng)篩選方法要么耗時(shí)數(shù)天，要么難以區(qū)分結(jié)構(gòu)相似的同分異構(gòu)體，導(dǎo)致錯(cuò)失關(guān)鍵活性變體。

近期，加州大學(xué)圣克魯茲分校的科研團(tuán)隊(duì)借助布魯克 timsTOF MALDI PharmaPulse（timsTOF MPP）高通量篩選方案，成功破解了這些難題。他們針對(duì)紅藻氨酸合成酶的 1054 個(gè)基因多樣化變體進(jìn)行篩選，不僅精準(zhǔn)區(qū)分了紅藻氨酸合成酶（KS）催化前紅藻氨酸（PKA）產(chǎn)生的兩種同分異構(gòu)產(chǎn)物 —— 紅藻氨酸（KA）和紅藻氨酸內(nèi)酯（KAL），更在 1.5 小時(shí)內(nèi)完成全部分析，篩選效率較傳統(tǒng)方法提升數(shù)百倍。團(tuán)隊(duì)最終成功識(shí)別出 7個(gè)性能優(yōu)異的變體：不僅 KAL 生成效率較原始酶大幅提升，部分變體（如 SL44、SL306）的底物轉(zhuǎn)化率突破 98%，解決了天然酶表達(dá)量低、穩(wěn)定性差的行業(yè)難題。

在傳統(tǒng)的篩選方法中，電噴霧電離（ESI）是常用的質(zhì)譜電離技術(shù)，而 ESI 對(duì)樣品的潔凈程度有很高的要求，因此常需要純化、萃取等繁瑣前處理。本文創(chuàng)新采用了 MALDI 離子化技術(shù)，依托其對(duì)鹽類、污染物的高耐受性，實(shí)現(xiàn)無需樣品前處理、直接對(duì)大腸桿菌菌落進(jìn)行原位分析，大幅簡化生物催化篩選的實(shí)驗(yàn)流程。

在 timsTOF MPP 平臺(tái) 10kHz 激光器的加持下，單樣本分析僅需 5 秒，318 個(gè)酶變體篩選耗時(shí)＜30 分鐘，1054 個(gè) KabC 基因多樣化變體全分析僅需 1.5 小時(shí)，較傳統(tǒng) LC-MS（單樣本最長 15 分鐘）效率提升數(shù)百倍。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，MALDI 離子化對(duì) KA 和 KAL 具備接近相同的電離效率，而 ESI 離子化下二者電離效率差異顯著（如圖1C所示），為后續(xù)的半定量分析提供了穩(wěn)定、可靠的技術(shù)基礎(chǔ)。

圖1：KA 與 KAL 的 MALDITIMSMS 分析方法優(yōu)化（A）TIMS工作原理示意圖。（B）KA 與 KAL 的 TIMS 分辨率優(yōu)化。降低電壓變化梯度和縮小淌度掃描范圍，使得分辨率達(dá)到最優(yōu)。（C）MALDITIMSMS 與 ESITIMSMS 測(cè)定 KA 和 KAL 相對(duì)豐度的對(duì)比。在對(duì)同一標(biāo)準(zhǔn)品混合物進(jìn)行檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，ESITIMSMS 中 KAL 的相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度降低了 65%，表明 MALDITIMSMS 更適用于兩者的相對(duì)定量分析。（D）采用 PRMPASEF 掃描模式可顯著降低譜圖的化學(xué)噪聲。

近年來，MALDI 成像技術(shù)憑借獨(dú)有的空間分布信息表征能力，成為突破傳統(tǒng)分析技術(shù)局限的關(guān)鍵，研究團(tuán)隊(duì)首次將其整合至生物催化高通量篩選流程中，實(shí)現(xiàn)對(duì)大腸桿菌菌落中 KA、KAL 的原位實(shí)時(shí)空間監(jiān)測(cè)與精準(zhǔn)半定量分析。

實(shí)驗(yàn)首先對(duì)將大腸桿菌菌落在瓊脂板點(diǎn)樣與培養(yǎng)，再將含培養(yǎng)好的菌落的瓊脂轉(zhuǎn)移至MALDI靶板，通過提取目標(biāo)離子的信號(hào)強(qiáng)度，從而確定了不加 IPTG+37℃ 培養(yǎng) 10h→30℃ 培養(yǎng) 6h，是瓊脂板上酶高效表達(dá)和產(chǎn)物生成的最優(yōu)條件（如圖2A所示）。

為將成像方法轉(zhuǎn)化為高通量篩選模式，還進(jìn)行了菌落直接點(diǎn)樣優(yōu)化：將大腸桿菌菌液均勻涂布于瓊脂板形成單菌落，用無菌牙簽將單菌落直接轉(zhuǎn)移至 MALDI 靶板并均勻鋪展，干燥后用基質(zhì)噴涂儀噴涂基質(zhì)，替代瓊脂塊轉(zhuǎn)移，進(jìn)一步簡化流程、適配大規(guī)模篩選。

最后基于優(yōu)化好的 MALDI-TIMS-MSI 方法實(shí)現(xiàn) KA/KAL 的空間分辨，實(shí)驗(yàn)證明 Y347F 突變體菌落的 KAL 相對(duì)豐度顯著高于野生型 DsKabC（如圖 2B 所示），與 LC-MS 驗(yàn)證結(jié)果一致（Y347F 的 KAL 產(chǎn)量比野生型高 7%），驗(yàn)證了成像數(shù)據(jù)的可靠性。

圖2：A）基于 MALDI 成像對(duì)瓊脂板上培養(yǎng)條件的優(yōu)化；B）基于 MALDI 成像對(duì)表達(dá)野生型 DsKabC 或 Y347F 突變體的大腸桿菌中 KA 和 KAL 異構(gòu)體的空間分布與半定量分析。

最終研究團(tuán)隊(duì)基于timsTOF MPP平臺(tái)對(duì)總計(jì) 1054 個(gè) KabC 變體進(jìn)行篩選，篩選出 7 個(gè) KAL 生成能力提升的嵌合酶變體，并后續(xù)進(jìn)行了純化和體外表達(dá)驗(yàn)證。