PCR對DNA片段進行擴增僅僅是一個重要的手段。目的是為了檢測和分析擴增片段。分析法的選用取決于研究的對象和研究的目的。擴增產(chǎn)物的大小可以通過瓊脂糖凝膠電泳的判斷,其對鑒定擴增產(chǎn)物有所幫助。點雜交不僅可以對擴增產(chǎn)物進行鑒定,而且還能幫助產(chǎn)物的分型。特異產(chǎn)物的大小通過Southern雜交分析能夠從非特異擴增產(chǎn)物中被鑒定出來。如PCR-ELISA,PCR-EIA,PCR-OLA等Z近發(fā)展的一系列產(chǎn)物分析法均對產(chǎn)物的精確分析有所幫助。
1.PCR-ELISA
這種方法沒有電泳和雜交的步驟,適于常規(guī)ELISA記數(shù)儀檢測。猶豫5'端修飾后依然能夠?qū)μ禺惏行蛄羞M行常規(guī)PCR擴增,所以,可以通過修飾一個引物的5′端使其攜帶便于PCR產(chǎn)物固定的功能基因,而通過另一引物5′-端的修飾使產(chǎn)物便于檢測。
2.微孔板夾心
這種方法是通過PCR產(chǎn)物的某一區(qū)域和固定在微孔板的捕獲探針特異雜交在微孔板上間接地固定產(chǎn)物。然后,再用PCR產(chǎn)物的另一區(qū)域和非放射性標記物標記的檢測探針雜交,漂洗后顯色即可判斷結(jié)果,這種方法是檢測一個產(chǎn)物需要兩個雜交過程,所以,和一次雜交的檢測法相比,兩次雜交的特異性更加的高。這種方法和PCR 32P探針的Southern雜交法有著不相上下的敏感性和特異性。然而PCR微孔板夾心雜交法操作更加的迅速,簡單,使同位素標記探針的危害得以避免。其非常適用于常規(guī)臨床實驗。
3.凝膠電泳
瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠電泳能夠有助于檢測PCR產(chǎn)物,Z常用的是瓊脂糖凝膠電泳,擴增產(chǎn)物的大小能夠通過電泳判斷出來。在臨床檢測中,檢測的需要只通過凝膠電泳判斷擴增片段大小就能夠得到滿足。將1.5g瓊脂糖加入100mlTBE,在微波鍋內(nèi)溶解,稍稍冷卻后倒入電泳槽,這是通常的制膠方法。
電泳后,用溴化乙淀染色20min,然后用去離子水漂洗2次,每次15min,在UV燈下觀察結(jié)果并拍照。
凝膠電泳除了能夠用來對產(chǎn)物的大小進行鑒定和擴增的情況進行檢測以外,還能夠?qū)U增產(chǎn)物進行純化。
4.點雜交
若擴增產(chǎn)物是多條帶,則更合適的方法為點雜交。這種方法的基本過程為:首先,在尼龍膜或硝酸纖維素濾膜上固定好擴增的DNA,再使用放射性或非放射性標記物標記的探針雜交。點雜交對突變DNA的突變類型檢測也有幫助,可以被用來分型某些基因和診斷人類遺傳病。放射性同位素32P標記的寡核苷酸探針檢測具有敏感性、特異性和可靠性。對人們認識某些疾病與基因變異的關(guān)系起了很大的作用。然而因為同位素不穩(wěn)定且具有放射性,不能夠在常規(guī)的臨床或法醫(yī)檢驗中使用。更加安全且方便的方法是用非放射性物質(zhì)(生物素、熒光素和地 高 辛等)標記的寡核苷酸探針分析PCR產(chǎn)物以確定核酸序列變異。非放射性標記物質(zhì)不但穩(wěn)定性高,而且使用方便、安全、檢測速度快。
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