理想的 WB 實驗長啥樣?

樣品量少、靈敏度高、數(shù)據(jù)重復性和可靠性都在線！賽默飛 618 大促進行中，不斥巨資，通通都能擁有！

今天我們來盤點一下都有哪些WB好物值得囤貨吧，還有每個步驟的常見問題解析，助您WB更絲滑。

問題1：使用RIPA裂解液時，為什么總蛋白產(chǎn)量偏低？

問題2：使用RIPA裂解液時如何防止蛋白降解？

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答：部分干擾 BCA 定量分析的物質(zhì)包括還原性物質(zhì)、螯合劑以及強酸或強堿，即使?jié)舛群艿鸵部赡軙绊懚康慕Y(jié)果：

另外，一些物質(zhì)對 BCA 定量分析方法的干擾程度較低，當其在原始樣品中含量低于某特定濃度時，僅對結(jié)果造成微小影響（可耐受）。此外，多種干擾物質(zhì)可能產(chǎn)生加和作用，例如當樣品緩沖液中含有多種干擾物質(zhì)時，即使其中單一干擾物質(zhì)的濃度低于可兼容濃度，總體仍有可能對蛋白質(zhì)的定量分析產(chǎn)生干擾。

答：主要由樣品中的干擾物質(zhì)決定。如果你的蛋白抽提試劑中含有大量去垢劑且不含有螯合劑、還原劑時，可使用BCA法；如果你的蛋白里含有EDTA等金屬螯合劑或者含有還原型物質(zhì)，且不含有去垢劑時，可使用Bradford法。

答：依據(jù)測試過的數(shù)據(jù)，Thermo Scientific M-PER，RIPA總蛋白抽提試劑，Mem-PER Plus膜蛋白抽提試劑，NE-PER核蛋白抽提試劑，亞細胞組分分離試劑盒等均可直接使用BCA進行蛋白定量，T-PER抽提后的蛋白經(jīng)過稀釋可使用BCA進行定量。

答：不能，檢測多肽濃度需要用專門的多肽濃度檢測試劑盒，如Pierce? Quantitative Fluorometric Peptide Assay（貨號23290），或Pierce? Quantitative Colorimetric Peptide Assay（貨號23275）。

答：全新Pierce 免稀釋Rapid Gold快速 BCA試劑盒（貨號A55860-2400 T，A55861-1200 T、A55862-96 T），只需孵育5分鐘，室溫下即可進行。再加上免稀釋BSA標準品的便利性，最快15分鐘即可搞定蛋白定量。此外，Rapid Gold BCA試劑盒保留了經(jīng)典BCA法的高線性、高去垢劑兼容性和低蛋白差異性，使用更加快捷、簡便。

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蛋白marker是日常實驗很常用的試劑，下面我們來一起看看使用過程中都有哪些常見問題吧。

當相同的蛋白質(zhì)在不同的SDS-PAGE緩沖系統(tǒng)（如 Bis-Tris 和 Tris-甘氨酸）中運行時，蛋白質(zhì)的遷移率會產(chǎn)生輕微差異。每種 SDS-PAGE 緩沖系統(tǒng)均具有不同的 pH 值，因而會影響蛋白質(zhì)的電荷及其與 SDS 的結(jié)合能力。蛋白質(zhì)遷移率的變化程度在天然蛋白質(zhì)中通常很小，但對于非典型或化學修飾的蛋白質(zhì)，如預染蛋白Marker，其變化更為明顯。

由于問題1中所述的蛋白遷移特性，所有預染蛋白Marker的表觀分子量都會因緩沖條件的不同而發(fā)生變化，所以應根據(jù)所用凝膠體系使用相匹配的表觀分子量，來更準確地定位您的目標蛋白。如需查看賽默飛蛋白Marker在各凝膠體系中的表觀分子量，請見產(chǎn)品說明書中的遷移模式示意圖（Migration Patterns）。

如果需要精準測定目標蛋白的分子量，推薦使用非預染蛋白Marker。兩大類蛋白Marker的推薦使用情形對比請見下表：

1. 由于Marker中含有SDS，其在低溫下易析出，因此marker在上樣前，需要在室溫進行回溫（如20-25℃回溫5-10分鐘），并在上樣前要充分輕柔混勻；避免低溫操作，可有效減少異常條帶的出現(xiàn)；

2. 上樣時使用無蛋白酶的吸頭（如高壓滅菌過的吸頭）進行上樣，避免蛋白酶引起蛋白降解，從而導致不可逆的條帶彌散；

3. 對于小膠（如8cm x 8cm），保證marker上樣量在1.0mm厚的膠中上樣至少5 μL，1.5mm厚的膠上樣至少10 μL；

4. 切勿煮沸或高溫孵育。

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可以。產(chǎn)品說明書中包含膜染色流程——用水清洗膜 1-2 分鐘，染色 2-5 分鐘，然后用 50% 甲醇、1% 乙酸脫色。為了獲得最佳膜染色效果，建議使用 MemCode 可逆性膜蛋白染色劑（貨號 24580、24585）。

是的。對于使用 MOPS 或 MES 電泳緩沖液進行電泳的凝膠，用 50% 甲醇和 7% 乙酸固定凝膠 15 分鐘，然后用水徹底清洗。

加之前必須將瓶內(nèi)物質(zhì)充分混合，以確保溶液均勻。

是的，通常用于考馬斯亮藍染色凝膠的操作都可以在 GelCode Blue 試劑染色凝膠上成功進行。

可以。IEF 凝膠可以染色，但必須先在 20% TCA 中固定 30 分鐘，然后用水清洗 30 分鐘；然后才能照常染色凝膠。

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以下是可能的原因和解決方案：

- 染色凝膠顯影過度。減少顯影時間。

- 遺漏了清洗步驟或使用的水質(zhì)量差。不要跳過或減少清洗步驟并使用超純水。

- 所用的容器或耗材有污染。使用用超純水沖洗的干凈容器或耗材。

- 凝膠制備中使用了不純化學品或預制凝膠已過期。請使用分析級化學品或使用未過期的預制凝膠。

- 終止溶液無法有效停止凝膠顯影。準備新的 5% 乙酸，并在與凝膠孵育的前幾分鐘內(nèi)更換兩次。

可以。文獻和分子生物學方案中的參考資料表明，可以使用此類銀染劑在聚丙烯酰胺凝膠中檢測核酸。

該方案在固定和染色時間方面非常靈活。凝膠固定至少 30 分鐘后，可以將其儲存在水中直到第二天。凝膠染色時間范圍為 5 分鐘至 24 小時，不會產(chǎn)生額外的背景。

1 分鐘敏化和 2 x 1 分鐘水洗步驟對于獲得最佳染色效果至關重要。顯色時間（2-3 分鐘）也很重要，一旦發(fā)生所需的顯色，就必須立即添加終止液。

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回答：曾經(jīng)嘗試成功轉(zhuǎn)印過200kD左右的大蛋白。我們還發(fā)現(xiàn)使用phos-tag蛋白膠進行植物、農(nóng)作物磷酸化蛋白研究時，Power Blotter可在10分鐘左右快速完成轉(zhuǎn)印，大大縮短濕轉(zhuǎn)所需的轉(zhuǎn)印時間，加速實驗進程。

回答：Power Blotter 為開放系統(tǒng)，只需搭配一瓶快轉(zhuǎn)液，每塊膠的成本低至8塊錢。還遇到過實驗室節(jié)約小能手，可把每塊膠成本降低到4塊錢。

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答：沒有一種底物能完全滿足所有WB需求。大家不妨在實驗室中常備SuperSignal West Pico PLUS底物進行日常檢測。它具有高飛克級靈敏度和較長信號持續(xù)時間，不僅滿足大部分常規(guī)實驗的需求，可多次成像，也是新靶點檢測的理想之選。同時，建議一起購置超敏底物，如SuperSignal West Atto底物，靈敏度能夠達到阿克級，超微量靶點也不在話下。如果超敏底物也檢測不出，可進一步排查抗體或樣本的問題。

圖1. SuperSignal? West Pico PLUS的信號穩(wěn)定持久。使用2倍梯度稀釋的HEK 293或HeLa細胞裂解物進行靶點的檢測 (起始量分別為4 μg /孔或20 μg /孔)。

答：二抗?jié)舛炔灰?，否則容易導致信號丟失。這是因為局部高濃度HRP在催化底物的同時也會產(chǎn)生大量的自由基，自由基可以導致HRP被氧化并被失活，進而導致信號輸出的衰減。同理，若信號迅速衰減，也可以嘗試減少二抗的用量。

圖2. 信號發(fā)射曲線示例。當WB體系中存在過量酶時，會在加入底物后迅速達到信號峰值，并迅速耗盡底物（信號1）. 在理想的體系中，信號強度會在加入底物約5分鐘后達到峰值，并維持若干小時的平臺期（信號2)。

答：千萬不要稀釋底物。首先，這會造成檢測體系的不穩(wěn)定。其次，底物的稀釋比例與信號強度之間沒有絕對相關性。比如，底物稀釋為原濃度的1/2，而信號并不是減少一半，極易導致實驗結(jié)果難以重復。