FluorCam葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)應(yīng)用案例（第四期）

——FluorCam葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)在國內(nèi)的應(yīng)用

FluorCam葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)作為實(shí)用化的葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)，是目前世界上權(quán)威、使用范圍廣、種類全面、發(fā)表論文多的葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)。FluorCam已經(jīng)發(fā)展出十幾個型號，涵蓋了從葉綠體、單個細(xì)胞、微藻到葉片、果實(shí)、花朵，乃整株植物和植物灌層，幾乎可以測量所有的植物樣品，甚包括含有葉綠素的微生物和動物。易科泰EcoTech生態(tài)實(shí)驗(yàn)室總結(jié)了FluorCam相關(guān)SCI參考文獻(xiàn)近500篇，可聯(lián)系EcoTech生態(tài)實(shí)驗(yàn)室（eco-lab@eco-tech.com.cn, info@eco-lab.cn）索取文獻(xiàn)目錄及全文。

FluorCam葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)在21世紀(jì)初引進(jìn)到國內(nèi)，但一直到2010年后國內(nèi)的科學(xué)家才在國際交流中逐漸發(fā)現(xiàn)這項(xiàng)技術(shù)的巨大價值，在短短數(shù)年中也利用這一技術(shù)發(fā)表了幾十篇高水平SCI文獻(xiàn)。本期主要介紹目前FluorCam葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)在國內(nèi)的應(yīng)用情況。

一、 植物光合生理研究

葉綠素?zé)晒饪梢灾苯臃磻?yīng)植物光系統(tǒng)的生理狀況，因此從葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)發(fā)明之初，就被用于各種植物光合生理研究。

山東農(nóng)科院使用FluorCam葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)研究了小麥旗葉與外露花梗光合能力的差異[1]。研究中發(fā)現(xiàn)在小麥生長前中期，旗葉與外露花梗的ZD光化學(xué)效率Fv/Fm和量子產(chǎn)額ΦPSII基本相同。但在生長后期，旗葉的光合能力顯著下降，而花梗光合能力的下降幅度要小于旗葉（圖1）。這證明了在生長后期的灌漿期，花梗對維持籽粒的生長更為重要。

圖1. 不同生長階段的旗葉（A，C）和外露花梗（B，D）的Fv/Fm（A，B）和ΦPSII（C，D）典型葉綠素?zé)晒獬上駡D

之后，他們又研究了小麥葉片和穎片季節(jié)衰老過程中以及穎果發(fā)育過程中光合特性的變化[2；3，圖2]。

圖2. 不同生長期小麥葉片和穎片的ZD光化學(xué)效率Fv/Fm（A）、量子產(chǎn)額ΦPSII（B）和非光化學(xué)淬滅NPQ（C）的變化

二、 植物生物/非生物逆境脅迫與抗逆性研究

由于幾乎所有種類的生物/非生物逆境脅迫都會影響到植物光合系統(tǒng)的正常生理功能，而葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)是公認(rèn)的植物逆境光合功能研究靈敏的無損探針。因此通過FluorCam葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)不但能反映植物受脅迫程度和抗逆能力的差異，而且能指明脅迫影響光合系統(tǒng)的具體機(jī)理過程。

1. 養(yǎng)分虧缺

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)使用FluorCam研究了兩種玉米在不同施氮條件下光合特性的變化[4]。研究發(fā)現(xiàn)，施加氮肥使兩個品種的ZD光化學(xué)效率Fv/Fm和量子產(chǎn)額ΦPSII都有所升高，而ΦPSII的升高幅度要高于Fv/Fm，表明氮肥對PSII的實(shí)際功能活性更有作用。同時玉米品種HZ4熒光參數(shù)的升高幅度也要高于Q319，這應(yīng)該是由于HZ4是一種低N效率的非持綠玉米（圖3）。

圖3. 氮對兩種玉米品種造成影響的葉綠素?zé)晒獬上駡D

2. 鹽堿脅迫

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)使用FluorCam研究發(fā)現(xiàn)S-adenosyl-L-methionine (SAM)基因過表達(dá)會顯著增加在堿脅迫下的番茄的光合能力[5]（圖4）。

圖4. 野生型和轉(zhuǎn)基因番茄葉片在堿脅迫下的Fv/Fm熒光成像圖

3. 水分脅迫

山東農(nóng)科院研究了不同灌溉方式對小麥光合特性的影響[6]。研究發(fā)現(xiàn)比起傳統(tǒng)的漫灌，溝灌條件下的小麥葉片有更高的ZD光化學(xué)效率Fv/Fm、量子產(chǎn)額ΦPSII、光化學(xué)淬滅qP和更低的非光化學(xué)淬滅NPQ（圖5）。這說明溝灌給小麥提供了更好的土壤水分條件，從而使小麥葉片擁有了更強(qiáng)的光化學(xué)活性。

圖5. 傳統(tǒng)漫灌和溝灌條件下小麥的Fv/Fm、ΦPSII、qP和NPQ熒光成像圖

國內(nèi)還有其他院校使用FluorCam開展了熱脅迫、病害、重金屬毒害、光質(zhì)影響等多種脅迫研究[7；8；9；10]。

三、 植物光合基因組學(xué)與分子生物學(xué)研究

植物光合作用可以說是植物對人類乃整個生物圈重要的功能，一方面為其他生物直接或間接地提供能量和食物，另一方面也在地球碳氧循環(huán)中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。因此，對植物光合作用功能基因的研究，一直是植物基因組學(xué)與分子生物學(xué)研究的重中之重。而葉綠素?zé)晒饽苤苯臃从诚嚓P(guān)功能基因的表型變化，所以幾乎所有與光合基因相關(guān)的研究都要用葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)來進(jìn)行表型篩選、基因功能驗(yàn)證等方面的工作。

1. 從光合表型到基因功能

中國科學(xué)院植物研究所張立新研究員是將FluorCam葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)引入國內(nèi)的科學(xué)家。中科院植物所光生物學(xué)ZD實(shí)驗(yàn)室是國內(nèi)植物光合基因相關(guān)研究前沿的科研單位。FluorCam葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)引入后就立刻用于了光合相關(guān)基因功能與表型研究。

2006年，張立新研究團(tuán)隊(duì)就使用FluorCam葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)研究了擬南芥ppt1突變體光系統(tǒng)II光化學(xué)能力的變化，進(jìn)而證明了磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對維持葉片生長后期正常光合作用的重要性[11]（圖6）。

之后，植物所張立新團(tuán)隊(duì)和彭連偉團(tuán)隊(duì)都使用FluorCam發(fā)表了多篇植物光合基因相關(guān)文獻(xiàn)[12；13]。

彭連偉在研究NADH脫氫酶復(fù)合體穩(wěn)定性時[14]，發(fā)現(xiàn)在50μmolphotons/m2.s的光強(qiáng)下，lhca5 lhca6 pgr5、lhca6 pgr5和crr4-2 pgr5擬南芥突變體都產(chǎn)生了生長阻滯，并表現(xiàn)出了高葉綠素?zé)晒猓▓D7A，B）。這表明了這些突變體的光合電子傳遞活性和NDH活性都受到了YZ。進(jìn)一步分析不同光強(qiáng)下的ΦPSII，野生型、lhca5和lhca6突變體的ΦPSII水平是相近的，這表明Lhca5和Lhca6在光合電子傳遞中都不是必需的（圖7C）。而lhca6 pgr5和lhca5 lhca6 pgr5的ΦPSII水平則顯著降低，通過其他結(jié)果比對發(fā)現(xiàn)這是由于在低光照條件下，這些突變體的PSI就受到了光YZ并出現(xiàn)了氧化應(yīng)激反應(yīng)。

在后續(xù)的研究中，彭連偉團(tuán)隊(duì)還使用FluorCam發(fā)現(xiàn)了NdhV亞基對NADH脫氫酶復(fù)合體穩(wěn)定性的重要作用[15]。其團(tuán)隊(duì)的張琳博士利用FluorCam封閉式熒光成像系統(tǒng)，從 T-DNA插入或EMS誘變的擬南芥突變體庫中篩選光合電子傳遞調(diào)控的突變體，并ZD研究了bfa3的功能，相關(guān)結(jié)果于 2016 年 4 月發(fā)表在國際學(xué)術(shù)期刊 Plant Physiology[16]。憑借這一科研發(fā)現(xiàn)，張琳博士榮獲易科泰FluorCam葉綠素?zé)晒獬上駜?yōu)秀論文一等獎。

圖7. lhca5 lhca6 pgr5三突變體葉綠素?zé)晒夥治觯?/span>A.可見表型；B.葉綠素?zé)晒獗硇?；C. ΦPSII測量

國內(nèi)另一個應(yīng)用FluorCam技術(shù)進(jìn)行光合基因研究較為出色的單位是西北農(nóng)林科技大學(xué)。他們引進(jìn)儀器技術(shù)雖然較晚，但在購置FluorCam開放式葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)后很快就發(fā)表了2篇高水平文章，研究了多個關(guān)于擬南芥葉綠體發(fā)育和葉片顏色相關(guān)的基因功能[17；18]（圖8）。

圖8. 擬南芥野生型與GTPase家族基因突變株的葉綠素?zé)晒獬上駡D

上海生命科學(xué)研究院青年研究組長、博士生導(dǎo)師Chanhong Kim在蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院、康奈爾大學(xué)博伊斯湯普森研究所工作期間就已經(jīng)使用FluorCam葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)進(jìn)行了大量的研究工作并在PNAS、Plant Cell發(fā)表多篇相關(guān)文獻(xiàn)。2014年，Chanhong Kim到上海生命科學(xué)研究院工作后立刻購置了一臺FluorCam封閉式葉綠素?zé)晒?GFP成像系統(tǒng)。他用這一系統(tǒng)一方面進(jìn)行GFP表達(dá)植株的快速篩選（圖9），另一方面進(jìn)行單線態(tài)氧和EXECUTER1介導(dǎo)信號在基粒中發(fā)生過程的研究，這一ZX研究成果發(fā)表同樣在2016年P(guān)NAS上[19]。

圖9. 使用FluorCam獲得的GFP成像圖，圖中發(fā)出明亮顏色的擬南芥植株即為表達(dá)了GFP的植株，其顏色越偏向紅色，則表明其表達(dá)的GFP更多，暗藍(lán)色的植株即為沒有表達(dá)GFP的植株

沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)也使用FluorCam技術(shù)開展了大白菜生長緩慢、類囊體減少的突變體光合特性的研究[20]。

2. 從基因功能到光合表型

在有的研究中，光合基因功能是通過其他方法基本上確定的。但這個基因表達(dá)出的表型是否符合預(yù)期，還是必須通過FluorCam葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)進(jìn)行光合表型方面的驗(yàn)證。

中國農(nóng)業(yè)大學(xué)與易科泰生態(tài)技術(shù)有限公司EcoTech生態(tài)實(shí)驗(yàn)室合作，從黃瓜中克隆了紫黃質(zhì)脫環(huán)氧化酶基因（CsVDE），再將這一基因的反義片段轉(zhuǎn)基因到擬南芥中[21]。發(fā)現(xiàn)在高光脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉綠素?zé)晒鈪?shù)非光化學(xué)淬滅NPQ比野生型顯著降低，這證明了CsVDE在葉黃素循環(huán)和PSII光YZ敏感性上的重要作用（圖10）。

圖10. 野生型與轉(zhuǎn)基因擬南芥在高光條件下的NPQ成像圖

四、 國際合作

由于FluorCam葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)引進(jìn)到國內(nèi)的時間較晚，國內(nèi)科學(xué)家對這一技術(shù)的運(yùn)用程度還低于歐美同行。因此，很多國內(nèi)的科學(xué)家目前是與國際上的知名科研院所開展合作，使用FluorCam進(jìn)行研究工作并發(fā)表文章。比如浙江大學(xué)與德國康斯坦茨大學(xué)合作發(fā)表的使用FKM多光譜熒光動態(tài)顯微成像系統(tǒng)（此系統(tǒng)應(yīng)用了FluorCam顯微成像技術(shù)，康斯坦茨大學(xué)Kupper教授和PSI公司合作完善了這一技術(shù)，是國際上對這一技術(shù)應(yīng)用前沿的學(xué)者）研究了銅對海州香薷Elsholtzia splendens光合系統(tǒng)的毒害作用[22]；華中農(nóng)業(yè)大學(xué)、江西農(nóng)業(yè)大學(xué)與德國洪堡大學(xué)等單位合作研究了病毒介導(dǎo)的豌豆基因沉默對四吡咯生物合成、葉綠體發(fā)育等造成的影響[23]；內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)與捷克科學(xué)院等單位合作開展的芽單胞菌門Gemmatimonadetes含有葉綠體的稀有細(xì)菌的光合特性和相關(guān)基因研究[24；25]；江蘇農(nóng)科院與英國諾丁漢大學(xué)合作研究的兩種病原菌對不同小麥品系的侵害性[26]等。

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